肌肉特異性酪氨酸激酶-紅色熒光蛋白融合熒光蛋白在HEK293細胞中的表達.pdf

1、目的：將構(gòu)建好的肌肉特異性酪氨酸激酶（MuSK）-紅色熒光蛋白（mCherry）融合蛋白（MuSK-mCherry）基因，轉(zhuǎn)染在人胚腎HEK293細胞中進行表達，為后續(xù)檢測重癥肌無力患者（MG）MuSK抗體制備抗原。
　　方法：將轉(zhuǎn)化有pMT/BiP/V5-His（MuSK–mCherry）的E coli DH5α擴大培養(yǎng)，提取出質(zhì)粒，電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察其位置確認是否含有pMT/BiP/V5-His（MuSK–mCher

2、ry）質(zhì)粒。分別在放有爬片的6孔細胞培養(yǎng)板和普通6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)人胚腎HEK392細胞，將提取出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚腎HEK293細胞中。轉(zhuǎn)染后取放有爬片的6孔細胞培養(yǎng)板第24小時的細胞，通過抗熒光猝滅封片劑封片，凝固后應用共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長為587 nm、發(fā)射波長為610 nm處觀察熒光圖像確認轉(zhuǎn)染表達的情況。在轉(zhuǎn)染后48小時內(nèi)每6個小時為一時間將轉(zhuǎn)染后的普通6孔細胞培養(yǎng)板中的細胞提取凍存為細胞團。將細胞團統(tǒng)一進行細胞裂解提取出蛋

3、白后，應用免疫印跡檢測技術檢測表達的融合蛋白，觀察條帶確認細胞表達情況及轉(zhuǎn)染后每個時間段的表達差異。
　　結(jié)果：通過電泳檢測于E coli DH5α中提取出的質(zhì)粒溶液在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，發(fā)現(xiàn)5647bp大小條帶，與理論條帶位置符合。在HE293細胞中轉(zhuǎn)染后通過免疫熒光圖像觀察到有紅色熒光蛋白，于每6小時的細胞團中提取的蛋白進行免疫印跡試驗，可觀察到72.4KDa大小條帶，與理論條帶位置符合，并觀察到轉(zhuǎn)染后每個時間段的表達有差異。