綠色熒光蛋白生色團的熒光增強及其在細胞成像中的應(yīng)用.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)具有特殊結(jié)構(gòu),在受到藍光或紫外線刺激時可以發(fā)射綠色熒光,并不需要任何協(xié)同因子、底物,因此自發(fā)現(xiàn)以來就受到人們的極大關(guān)注。由于其熒光穩(wěn)定,檢測簡單,結(jié)果真實可靠,并且對光漂白、氧化劑、還原劑以及其他許多化學試劑具有極強的穩(wěn)定性,易于構(gòu)建載體,因此適合用作普遍的報告標記,尤其適合于活體細胞或組織。目前,GFP已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達標記、蛋白質(zhì)定位、生物傳感器、分子生物學、生物探針和生物成像等領(lǐng)域。
　　GFP的發(fā)

2、光機理可簡要描述為:GFP通過折疊促使內(nèi)部三個氨基酸形成生色團,同時折疊鏈通過分子內(nèi)氫鍵使GFP形成筒狀結(jié)構(gòu)而生色團被束縛在中間。由于生色團分子自由旋轉(zhuǎn)被限制,從而表現(xiàn)出強烈的熒光。如果這種結(jié)構(gòu)解組裝,則GFP的熒光非常微弱。從本質(zhì)上講,GFP熒光增強是因為蛋白分子從低級結(jié)構(gòu)形成筒狀結(jié)構(gòu)時內(nèi)部生色團自由旋轉(zhuǎn)受到限制,因此可以認為 GFP通過分子自組裝增強了自身的熒光性能。
　　為了模擬GFP的發(fā)光過程,本文首先通過2,3-環(huán)加成法

3、合成了GFP生色團分子,并根據(jù)需要對其中一個生色團分子末端羥基進行了丙烯?；图谆；男揎棥λ么蟛糠种虚g體和所有產(chǎn)物進行了核磁、高分辨質(zhì)譜以及紅外的表征,并對所有數(shù)據(jù)進行了詳細分析。所得核磁數(shù)據(jù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)都證明了相應(yīng)中間體或產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及分子量,紅外數(shù)據(jù)進一步證明了其結(jié)構(gòu)。
　　然后通過合成的聚乙二醇大分子引發(fā)劑引發(fā)甲基丙烯酸甲酯進行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合,獲得了不同分子量的兩親性嵌段聚合物,核磁、紅外、凝膠滲透色譜等證明了合

4、成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。然后根據(jù) GFP的發(fā)光原理,將合成的兩親性聚乙二醇-b-聚甲基丙烯酸甲酯與生色團進行自組裝形成納米粒子,并用動態(tài)光散射和透射電鏡表征了其尺寸及結(jié)構(gòu)。聚合物與生色團組成的納米粒子模擬了GFP生色團的發(fā)光,并被成功地用于細胞成像。光學性能的表征證明了對 GFP發(fā)光的成功模擬,而細胞成像則驗證了其應(yīng)用。由于兩親性聚合物合成的可設(shè)計性、分子量和鏈段的可調(diào)控性、組裝體制備的簡便性,使得通過聚合物自組裝包覆生色團進行成像有良好的應(yīng)用前