超電荷綠色熒光蛋白在生化傳感中的研究與應(yīng)用.pdf

1、超電荷綠色熒光蛋白(ScGFP)是一種表面帶很高凈電荷的新型功能蛋白，通過(guò)遺傳修飾的手段對(duì)綠色熒光蛋白進(jìn)行表面重構(gòu)獲得的。ScGFP具有很強(qiáng)的水溶性和抗蛋白聚集的能力，在生物技術(shù)，醫(yī)藥和材料科學(xué)方面有著廣泛的應(yīng)用前景。此外，帶正電荷的ScGFP能夠穿透細(xì)胞膜，具有運(yùn)載核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的能力。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體相比，ScGFP有細(xì)胞毒性低，轉(zhuǎn)運(yùn)效率高和廣泛的細(xì)胞普適性等優(yōu)點(diǎn)。帶正電荷的ScGFP與帶負(fù)電荷的電核酸分

2、子之間通過(guò)靜電相互作用形成自組裝的多離子復(fù)合物，這與生物體中組蛋白和帶負(fù)電的DNA之間自組裝成染色質(zhì)的行為非常相似。ScGFP具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，穿透細(xì)胞膜的能力，以及與核酸之間有很強(qiáng)的靜電相互作用等特性，因此，可以基于ScGFP來(lái)開(kāi)發(fā)用于生化分析的傳感平臺(tái)。但是到目前為止，ScGFP在生化檢測(cè)中的應(yīng)用還非常少。本文利用ScGFP(+36)作為識(shí)別和信號(hào)響應(yīng)元件，開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于ScGFP的簡(jiǎn)單通用的傳感平臺(tái)，用于重大疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物的

3、檢測(cè)。本文的要點(diǎn)歸納如下：
　　(1)構(gòu)建用于原核表達(dá)ScGFP的重組載體，以及ScGFP的表達(dá)和純化。從ScGFP的氨基酸殘基序列反推出ScGFP的基因序列(scgfp)，并結(jié)合大腸桿菌偏好的密碼子系統(tǒng)對(duì)序列進(jìn)行優(yōu)化。攜帶ScGFP的基因序列的質(zhì)粒pUC19-scgfp通過(guò)全基因人工合成的方式獲得。將質(zhì)粒pUC19-scgfp和pET28混合于一個(gè)PCR管中，然后通過(guò)“一鍋法”獲得重組質(zhì)粒pET28-scgfp。本文中發(fā)展的“一

4、鍋法”能夠在2 h內(nèi)完成重組質(zhì)粒的構(gòu)建工作，所有過(guò)程在同一個(gè)PCR管中完成，無(wú)需額外的DNA分離和回收步驟。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入pET28-scgfp大腸桿菌中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)ScGFP。在AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)上通過(guò)Ni-NTA柱和脫鹽柱進(jìn)行純化，獲得了高純度的ScGFP。
　　(2)ScGFP與DNA之間的靜電相互作用。以20 bp的DNA作為模型，研究發(fā)現(xiàn)，ScGFP/DNA納米復(fù)合體形成速度非?？?20 s)，經(jīng)動(dòng)態(tài)光

5、散射表征發(fā)現(xiàn)，復(fù)合體的平均粒徑為568±46 nm，并且進(jìn)一步地通過(guò)原子力顯微鏡表征得到證實(shí)。此外，能夠用共聚焦熒光顯微鏡直接觀察到ScGFP/DNA納米復(fù)合體。形成ScGFP/DNA納米復(fù)合體后，ScGFP的熒光增強(qiáng)了~40％，這可能是因?yàn)镾cGFP分子的周圍微觀環(huán)境發(fā)生了改變。此外，ScGFP被包裹到ScGFP/DNA納米復(fù)合體中時(shí)，熒光各向異性顯著地降低，從0.3減小到0.07，這是由于復(fù)合體中緊鄰的ScGFP分子之間發(fā)生了hom

6、o-FRET。當(dāng)DNA被標(biāo)記上猝滅基團(tuán)時(shí)，ScGFP/DNA納米復(fù)合體中ScGFP的熒光被高效的猝滅，最大猝滅率達(dá)到了95%?；贒NA濃度依賴的熒光猝滅曲線，計(jì)算出ScGFP與20 bp的DNA的解離常數(shù)(Kd)為0.33 nM。
　　(3)ScGFP作為簡(jiǎn)單而通用的探針用于DNA檢測(cè)和DNA甲基化分析。作為一個(gè)原理的驗(yàn)證，本文發(fā)展了ScGFP的一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域，即作為一個(gè)通用的傳感平臺(tái)用于核酸檢測(cè)和表觀遺傳學(xué)分析。將ScGFP

7、作為信號(hào)報(bào)道分子，基于多離子的ScGFP/DNA納米復(fù)合物和支點(diǎn)介導(dǎo)的鏈取代反應(yīng)，發(fā)展了一個(gè)簡(jiǎn)單的“turn-on”模式來(lái)檢測(cè)DNA的新方法。該分析方法具有較高的靈敏度(檢測(cè)限1nM)和很好的區(qū)分單堿基錯(cuò)配的能力(目標(biāo)DNA序列與單堿基錯(cuò)配的序列的信號(hào)相差10倍)。此外，與重亞硫酸鹽處理相結(jié)合，這個(gè)基于ScGFP的分析方法被進(jìn)一步用于高靈敏地分析結(jié)腸癌組織樣品的基因組DNA中特定位點(diǎn)的甲基化水平。
　　(4)ScGFP作為一個(gè)通用

8、的傳感平臺(tái)用于核酸酶和甲基轉(zhuǎn)移酶酶活性分析。本文中，基于多離子的ScGFP/DNA納米復(fù)合體，發(fā)展了一個(gè)靈敏的“switch-on”模式的生物傳感平臺(tái)，用于限制性和非限制性核酸酶，以及甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析。S1核酸酶對(duì)探針DNA的切割導(dǎo)致猝滅基團(tuán)從探針上釋放和遠(yuǎn)離ScGFP，繼而使得 ScGFP的熒光得到恢復(fù)。因此，實(shí)現(xiàn)了對(duì)S1核酸酶活性簡(jiǎn)單的“turn-on”模式的分析，該分析方法具有較寬的線性范圍(0.008–0.4 U/mL)和低

9、的檢測(cè)限(0.002 U/mL)?；谕瑯拥膫鞲胁呗?，對(duì)探針DNA進(jìn)行適當(dāng)改變，該分析方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)限制性內(nèi)切酶EcoRI高靈敏度分析(檢測(cè)限1.3 U/mL)。類似地，借助甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶DpnI，本方法又進(jìn)一步應(yīng)用到Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)和抑制劑分析。
　　(5)H39GFP作為一個(gè)新型傳感平臺(tái)用于免標(biāo)記檢測(cè)金屬離子和酶活性。蛋白表面重構(gòu)是對(duì)一個(gè)蛋白質(zhì)的表面進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，而保留蛋白原有的折疊和功能的技術(shù)。H39GFP，

10、一種通過(guò)蛋白表面重構(gòu)技術(shù)開(kāi)發(fā)出的一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含了39個(gè)組氨酸殘基的新型綠色熒光蛋白。H39GFP有很多優(yōu)良的性質(zhì)，包括異常的穩(wěn)定性，穿透細(xì)胞膜的能力和可調(diào)控的表面凈電荷等。本文中，利用H39GFP作為信號(hào)識(shí)別和報(bào)道分子，基于Cu2+的熒光猝滅效應(yīng)和H39GFP的多價(jià)的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了一個(gè)免標(biāo)記的Cu2+熒光傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，H39GFP與Cu2+之間的結(jié)合速度很快并且具有很高的結(jié)合力(Kd=16.2 nM)。該分析方法提供了一個(gè)

11、簡(jiǎn)單的“混合-讀取”的方式來(lái)檢測(cè)Cu2+,對(duì)50 nM–2.0μM的Cu2+有線性響應(yīng)，最低檢測(cè)濃度為50 nM。此外，進(jìn)一步將基于H39GFP的Cu2+分析方法用于乙酰膽堿酯酶(AChE)活性檢測(cè)及其抑制劑篩選。AChE水解硫代乙酰膽堿(ATC)生成硫代膽堿(thiocholine),硫代膽堿與Cu2+反應(yīng)生成Cu-(thiocholine)2，從而使 H39GFP的熒光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)“switch-on”模式檢測(cè)AChE活性。本方法實(shí)現(xiàn)