基于超電荷綠色熒光蛋白與納米材料的傳感及納米材料毒性研究.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)是生物體自身編碼表達(dá)的一種蛋白，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的研究及應(yīng)用。新近發(fā)現(xiàn)的GFP突變體，超電荷綠色熒光蛋白(scGFP)，具有高抗鹽性、pH穩(wěn)定性、可以作為核酸載體等性質(zhì)。目前關(guān)于scGFP與納米材料的相互作用及其在生物傳感上的應(yīng)用還未見報(bào)道。與納米技術(shù)的快速發(fā)展相比，納米材料毒性研究還處于初級(jí)階段，相關(guān)毒性機(jī)理需要深入探討。
　　本文詳細(xì)研究了scGFP與氧化石墨烯(GO)的相互作用，基于此開發(fā)了一

2、種無(wú)標(biāo)記熒光傳感器用于肌紅蛋白檢測(cè)。另外，利用全細(xì)胞傳感器研究了表面形貌對(duì)納米銅毒性的影響。具體工作如下:
　　1、首次研究了scGFP與GO的相互作用，并且探討了DNA對(duì)scGFP/GO相互作用的影響。通過(guò)原子力顯微鏡、熒光偏振、圓二色譜等表征手段，發(fā)現(xiàn)seGFP除了通過(guò)π-π;堆積作用與GO結(jié)合，還能夠通過(guò)靜電作用吸附在GO表面，使單層GO聚集成多層GO，形成scGFP/GO復(fù)合物。該seGFP/GO復(fù)合物中，scGFP與GO

3、足夠靠近，發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移，scGFP熒光被GO猝滅。當(dāng)引入DNA時(shí)，DNA會(huì)與scGFP結(jié)合，并且拉近scGFP之間的距離使scGFP聚集成較大的顆粒。再加入GO時(shí)，聚集的scGFP大顆粒只能吸附在帶有羥基和羧基基團(tuán)的GO的邊緣，GO不會(huì)聚集。大顆粒的空間位阻使其中大部分scGFP與GO遠(yuǎn)離，熒光保留。
　　2、利用新近篩選的肌紅蛋白核酸適體(MA)，構(gòu)建了一種基于GO/scGFP相互作用的核酸傳感器用于無(wú)標(biāo)記檢測(cè)肌紅蛋白。

4、scGFP與GO相互作用時(shí)能夠猝滅scGFP的熒光;當(dāng)有肌紅蛋白核酸適體MA存在時(shí)，scGFP會(huì)與MA結(jié)合發(fā)生團(tuán)聚，再吸附在GO邊緣，熒光會(huì)保留;當(dāng)有肌紅蛋白存在時(shí)，MA特異性地與肌紅蛋白結(jié)合，scGFP就會(huì)再次與GO相互作用，熒光猝滅。通過(guò)檢測(cè)熒光的變化可以定量檢測(cè)肌紅蛋白。本方法對(duì)肌紅蛋白的檢測(cè)獲得了較低的檢測(cè)限(0.16μg/mL)和較寬的線性范圍（0.3μg/mL-10μg/mL）。本方法成功運(yùn)用于實(shí)際血清樣品中肌紅蛋白的檢測(cè)，

5、且在添加回收實(shí)驗(yàn)中獲得了很好的回收效果，回收率為87.7-107.6％。由于scGFP與GO都有很好的生物相容性，本方法有潛力應(yīng)用在生物樣品的檢測(cè)中。如果更換核酸適體，本方法可以用于檢測(cè)其他蛋白、癌細(xì)胞等，擴(kuò)展了GO以及scGFP的應(yīng)用范圍。
　　3、利用微生物全細(xì)胞傳感器研究了納米銅表面形貌對(duì)其毒性的影響。比較了購(gòu)買的納米銅球形顆粒與合成的八面體籠結(jié)構(gòu)、納米花結(jié)構(gòu)以及小粒子納米銅的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)形貌不同產(chǎn)生的毒性大小也不同。進(jìn)一