新型熒光納米材料碳點(diǎn)的毒性及作用機(jī)制研究.pdf

1、將納米材料用于生物標(biāo)記與診斷成像，是當(dāng)前納米科技應(yīng)用于腫瘤醫(yī)學(xué)新興的研究領(lǐng)域，如何應(yīng)用納米材料獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子效應(yīng)、光、電、磁效應(yīng)等性質(zhì)來設(shè)計(jì)生物相容性良好的腫瘤診斷分子探針，提高腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的特異性與靈敏度，是目前腫瘤醫(yī)學(xué)對(duì)納米科技提出的極具挑戰(zhàn)性的問題。
　　納米材料要轉(zhuǎn)化為醫(yī)藥產(chǎn)品應(yīng)用于臨床，其生物安全性是一個(gè)必須解決的關(guān)鍵問題。迄今為止，國(guó)際上尚未制定出一套用于納米材料評(píng)價(jià)特定的指導(dǎo)原則。多數(shù)納米醫(yī)藥制品

2、的安全評(píng)價(jià)依然采用常規(guī)毒理學(xué)的評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則。已有的研究表明，納米材料的尺寸形狀、表面電荷及其表面修飾等性質(zhì)均會(huì)對(duì)其生物學(xué)行為與生物效應(yīng)產(chǎn)生影響。近年來一些納米醫(yī)藥產(chǎn)品，經(jīng)常規(guī)毒理學(xué)評(píng)價(jià)定為無毒，但在使用過程中卻因?yàn)闄z測(cè)到新的毒作用而被美國(guó)FDA撤出臨床。常規(guī)毒理學(xué)越來越不能適應(yīng)對(duì)納米生物醫(yī)藥制品安全評(píng)價(jià)的要求。制定一套客觀并能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)納米顆粒在暴露過程中對(duì)機(jī)體可能得毒性作用的評(píng)價(jià)方法迫在眉睫，納米毒理學(xué)所肩負(fù)的任務(wù)任重而道遠(yuǎn)。
　

3、　碳點(diǎn)是一種新型的熒光碳納米顆粒，其粒徑一般在10nm以下，具有良好的分散性和熒光穩(wěn)定性。這種碳納米材料具有傳統(tǒng)熒光染料所不具備的諸多優(yōu)良性質(zhì)，如:熒光強(qiáng)度高、抗光漂白能力強(qiáng)、激發(fā)光譜連續(xù)等。此外，碳點(diǎn)具有很好的水溶性，其表面的羧基易于進(jìn)行生物偶聯(lián)與功能化修飾。碳點(diǎn)本身不含有任何有毒元素，與半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，展現(xiàn)出卓越的生物兼容性和環(huán)境友好性鑒于上述諸多優(yōu)良的理化性質(zhì)，碳點(diǎn)極具制備腫瘤診斷探針的潛質(zhì)，但是目前針對(duì)于碳點(diǎn)安全性評(píng)價(jià)的研究卻

4、非常稀少，評(píng)價(jià)內(nèi)容也不全面、不系統(tǒng)，對(duì)碳點(diǎn)可能的毒性作用機(jī)制更是缺乏深入的研究。
　　本課題承接了國(guó)家973項(xiàng)目——“應(yīng)用納米技術(shù)解決胃癌預(yù)警與早期診斷中的關(guān)鍵科學(xué)問題”中碳點(diǎn)（一種用于標(biāo)記胃癌早期診斷探針的納米材料）對(duì)生物體的毒理效應(yīng)及其作用機(jī)制的評(píng)價(jià)研究任務(wù)，我們以國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥物評(píng)價(jià)指南為基礎(chǔ)和指導(dǎo)，參照國(guó)際化學(xué)物毒理學(xué)檢測(cè)指南對(duì)碳點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)和致毒機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)性評(píng)價(jià)。
　　研究?jī)?nèi)容包括:
　　(1

5、)碳點(diǎn)的理化性質(zhì)表征。采用原子力顯微鏡、紫外可見光譜儀、熒光光度計(jì)等儀器分別對(duì)硝酸氧化法制備碳點(diǎn)的形貌、粒徑、吸收光譜、熒光光譜及熒光量子產(chǎn)率等參數(shù)進(jìn)行了表征。
　　(2)碳點(diǎn)的急性、亞急性毒性測(cè)定。分別選用BALB/C小鼠和Wistar大鼠，一次性尾靜脈注射染毒，記錄了受試動(dòng)物在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)一般狀況、食物利用率、體重、血液學(xué)、血清生化指標(biāo)的變化及主要臟器的病理改變。
　　(3)碳點(diǎn)的遺傳毒性評(píng)價(jià)。選用沙門氏菌回復(fù)突變?cè)?/p>

6、驗(yàn)（受試菌株為鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102）、染色體畸變?cè)囼?yàn)、堿性單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)及骨髓微核試驗(yàn)四個(gè)組合試驗(yàn)對(duì)碳點(diǎn)的致基因突變、染色體畸變和DNA損傷效應(yīng)進(jìn)行了測(cè)定。
　　(4)碳點(diǎn)對(duì)免疫功能的影響。選用BALB/C小鼠作為模式動(dòng)物，以尾靜脈單次及多次注射的方式染毒，在給藥后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)、淋巴細(xì)胞種類及亞群分析、巨噬細(xì)胞中性紅吞噬試驗(yàn)、免疫相關(guān)細(xì)胞因子分泌及表達(dá)水平檢測(cè)、免疫器官病理

7、形態(tài)分析等方法分別研究了碳點(diǎn)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞功能、T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞增殖活性及其介導(dǎo)的免疫功能和相關(guān)免疫器官病理變化的影響。
　　試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)碳點(diǎn)的理化性質(zhì)表征結(jié)果表明，碳點(diǎn)的顆粒直徑在5～10 nm，紫外、紅外光譜證實(shí)了碳點(diǎn)表面富含羧基和羥基基團(tuán)，從結(jié)構(gòu)上闡明了碳點(diǎn)具有很好的水溶性。熒光光譜分析表明碳點(diǎn)隨著激發(fā)光的不同可以發(fā)不同顏色的熒光，裸碳點(diǎn)在340 nm激發(fā)，可以發(fā)射強(qiáng)的藍(lán)色熒光，其熒光量子產(chǎn)率在0.

8、8％左右。
　　(2)碳點(diǎn)以單次靜脈注射方式染毒對(duì)模式動(dòng)物沒有明顯的急性、亞急性毒性。動(dòng)物的一般狀況良好;食物利用率、體重、血液學(xué)、血清生化指標(biāo)均沒有出現(xiàn)異常變化;主要臟器無明顯的病理改變。
　　(3)遺傳毒性組合試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，碳點(diǎn)在受試劑量?jī)?nèi)不能誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生突變，對(duì)CHL細(xì)胞的染色體無致畸變作用，無明顯的DNA損傷效應(yīng)，不能誘發(fā)受試動(dòng)物的骨髓紅細(xì)胞發(fā)生微核突變，說明碳點(diǎn)無明顯的遺傳毒性。
　　(4)免疫

9、毒性研究結(jié)果表明，碳點(diǎn)尾靜脈注射單次染毒，在暴露早期，巨噬細(xì)胞被激活功能增強(qiáng)，IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌水平增加，但未見淋巴細(xì)胞種群與數(shù)量的顯著變化，未誘發(fā)明顯的免疫效應(yīng);但在染毒后第9天，碳點(diǎn)能顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化增殖，提高IFN-γ與TNF-α的分泌水平，增強(qiáng)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)。碳點(diǎn)多次染毒，T淋巴細(xì)胞亦出現(xiàn)明顯增殖，IFN-γ與TNF-α相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平增加，且在基因水平的表達(dá)上調(diào)。碳點(diǎn)的持續(xù)暴露作用誘發(fā)了機(jī)體的氧化

10、應(yīng)激損傷，破壞了機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)，導(dǎo)致相關(guān)靶器官出現(xiàn)了可代償?shù)牟±聿∽儭?br>　　本論文立題于當(dāng)前極具挑戰(zhàn)的納米材料安全性研究方向，通過一系列分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平的試驗(yàn)，首次對(duì)碳點(diǎn)的生物安全性做了較系統(tǒng)、全面地評(píng)價(jià)。一般毒性與遺傳毒性評(píng)價(jià)結(jié)果表明碳點(diǎn)在受試劑量?jī)?nèi)沒有明顯的毒性作用;免疫毒性研究結(jié)果顯示，碳點(diǎn)在單次染毒時(shí)可以促進(jìn)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)，但在多次給藥的情況下，碳點(diǎn)可誘發(fā)機(jī)體相關(guān)免疫器官發(fā)生可代償?shù)牟±聿∽儭Ｉ鲜鲈囼?yàn)結(jié)果