Arg9-EGFP綠色熒光蛋白的穿膜效果研究.pdf

1、藥物分子進(jìn)入細(xì)胞是藥物投遞系統(tǒng)中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞有膜的存在，使蛋白質(zhì)、核酸類(lèi)等許多具有生物活性的大分子藥物無(wú)法直接進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致此類(lèi)藥物在實(shí)際使用中出現(xiàn)許多局限，難以起到治療效果。
　　細(xì)胞穿膜肽能攜帶多種活性目的分子高效進(jìn)入細(xì)胞。近20年來(lái)，多種細(xì)胞穿膜肽被陸續(xù)證實(shí)并報(bào)道。對(duì)細(xì)胞穿膜肽結(jié)構(gòu)及生物化學(xué)性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿膜肽具有以下共同特性：（1）都包含一段長(zhǎng)短不一的正電荷多肽，富含精氨酸和賴(lài)氨酸等堿性氨基酸；（

2、2）穿膜肽二級(jí)結(jié)構(gòu)中都存在α-螺旋空間結(jié)構(gòu)。其中，富含精氨酸的穿膜多肽被深入研究，發(fā)現(xiàn)一段單獨(dú)的多聚精氨酸就能夠順利實(shí)現(xiàn)跨膜，其穿膜效應(yīng)不具有細(xì)胞選擇性，使之成為目前應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)穿膜肽。
　　為實(shí)現(xiàn)外源蛋白有效穿膜的過(guò)程，本文探討了細(xì)胞穿膜肽 Arg9介導(dǎo)的綠色熒光蛋白蛋白的穿膜作用。通過(guò)構(gòu)建 pET-15b-Arg9-EGFP原核表達(dá)載體，利用適宜濃度的IPTG誘導(dǎo) DE3大腸桿菌原核表達(dá)體系以及 His標(biāo)簽純化系統(tǒng)，純化獲

3、得 Arg9-EGFP蛋白；運(yùn)用乳腺癌 MCF-7細(xì)胞模型，檢測(cè) Arg9穿膜肽的穿膜效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們成功制備了Arg9-EGFP融合蛋白。與不含 Arg9穿膜肽的EGFP蛋白相比，Arg9-EGFP融合蛋白可有效穿膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并顯示劑量依賴(lài)性。熒光檢測(cè)結(jié)果表明，進(jìn)入細(xì)胞的Arg9-EGFP蛋白主要聚集在細(xì)胞漿內(nèi)。本研究表明 Arg9細(xì)胞穿膜肽可以有效介導(dǎo)目標(biāo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，并保持目標(biāo)蛋白的大分子活性，有望成為實(shí)現(xiàn)特定蛋白穿膜