綠色熒光蛋白的定點(diǎn)突變及新型T載體構(gòu)建研究.pdf

1、TA克隆是最簡(jiǎn)潔、高效的克隆PCR產(chǎn)物的方法之一，在沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行載體間的DNA片段亞克隆時(shí)尤其有用。T載體具有3?末端單一的T凸出尾，使其能夠直接與3?端具有A凸出尾的PCR產(chǎn)物高效連接。常用T載體的不足之處在于需要IPTG誘導(dǎo)和X-gal顯色劑，例如藍(lán)白斑篩選；或者菌株生長(zhǎng)不穩(wěn)定，如利用毒蛋白或殺菌肽構(gòu)建的T載體。最近綠色熒光蛋白(GFP)被用于構(gòu)架T載體的篩選試劑，插入片段和T載體的重組菌落可以在可見(jiàn)光下進(jìn)行鑒定，但是仍

2、然需要IPTG誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)使用一種新型GFP突變體Emerald作為細(xì)胞熒光指示劑，構(gòu)建新型靈敏的T載體。主要結(jié)果如下：
　　 1、定點(diǎn)突變：定點(diǎn)突變綠色熒光蛋白突變體EGFP(F64L–S65T–H231L)，獲得4個(gè)氨基酸殘基突變的Emerald突變體(S72A，N149K，M153T和I167T)。
　　 2、胞外分析：構(gòu)建大腸桿菌Emerald的表達(dá)載體p28SUMO-emerald。表達(dá)并純化重組蛋白Emera

3、ld，并分析其紫外可見(jiàn)光譜和熒光掃描光譜性質(zhì)與報(bào)道一致。重組Emerald在Hampton Screen Ⅰ&Ⅱ的第39號(hào)條件：2mol/L(NH4)2SO4，0.1 mol/L HEPES-NaOH，pH 7.5，2％ PEG400中晶體生長(zhǎng)最優(yōu)，為柱狀晶型。
　　 3、胞內(nèi)分析：Emerald基因連入pUC18載體后，上游添加增強(qiáng)子以增強(qiáng)表達(dá)效果，在不加IPTG和X-gal的條件下，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，大腸桿菌重組菌落在可見(jiàn)

4、光下顯示綠色。添加增強(qiáng)子后，菌液每毫克上清總蛋白熒光強(qiáng)度提高至原來(lái)的3.3倍。
　　 4、同義突變：根據(jù)GFP的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，分別在Emerald突變體第4和第5個(gè)β折疊片層結(jié)構(gòu)上選擇了2個(gè)突變位點(diǎn)，即第93位的V和第109位的R，分別創(chuàng)建SnaBⅠ和SmaⅠ酶切序列。
　　 5、T載體構(gòu)建及驗(yàn)證：構(gòu)建pESN-T和pESM-T載體。將約500bp外源PCR片段分別與兩種T載體連接，重組菌斑為白色，對(duì)照在可見(jiàn)光下為綠

5、色。
　　 6、插入突變：為了驗(yàn)證T載體的靈敏性，利用定點(diǎn)突變的方法分別在pESN和pESM載體的SnaBⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)識(shí)別序列中間添加一個(gè)三核苷酸序列TCC。平板轉(zhuǎn)化以及菌液上清總蛋白熒光強(qiáng)度分析顯示綠色熒光消失，插入突變后的Emerald蛋白在包涵體中表達(dá)，折疊性和表達(dá)量均受到大幅度影響。
　　 綜上所述，本文研究了綠色熒光蛋白突變體Emerald在大腸桿菌胞外和胞內(nèi)性質(zhì)，選取兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SnaBⅠ和S