Lipocalin2-綠色熒光蛋白融合載體的構(gòu)建及在人腎小管上皮細胞的定位.pdf

1、目的：構(gòu)建并鑒定Lipocalin2/綠色熒光蛋白融合載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入人腎近曲小管上皮細胞，觀察其在人腎近曲小管上皮細胞中的表達和定位情況。 方法：根據(jù)基因文庫(編碼BC033089)報道的Lipocalin2基因cDNA序列合成引物擴增Lipocalin2全編碼區(qū)，并在Lipocalin2全編碼區(qū)兩端分別加上限制性內(nèi)切酶：NSPV和Xho Ⅰ酶切位點。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定為Lipocalin2基因全編碼區(qū)后，回收、純

2、化Lipocalin2基因。擴增真核表達質(zhì)粒pReceiver-M29(其上有綠色熒光蛋eGFP標簽)，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取、純化真核表達質(zhì)粒pReceiver-M29 DNA。用NSP V和Xho Ⅰ分別酶切Lipocalin2DNA和真核表達質(zhì)粒pReceiver-M29 DNA，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收、純化產(chǎn)物后，利用T4 DNA連接酶將Lipocalin2連接到真核表達質(zhì)粒pReceiver-M29中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大

3、腸桿菌，挑取單個克隆，提取質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶NSP V和Xho Ⅰ酶切含有Lipocalin2基因的pReceiver-M29質(zhì)粒，電泳初步鑒定是否構(gòu)建重組質(zhì)粒pReceiver-M29-Lipocalin2成功，進一步DNA測序鑒定是否構(gòu)建重組質(zhì)粒成功。體外復(fù)蘇培養(yǎng)正常人腎近曲小管上皮細胞株(HK-2)，取對數(shù)生長期細胞0.25％胰蛋白酶消化，2×105/個接種于共聚焦dish中，待細胞長到80％左右融合時，無血清164

4、0培養(yǎng)基培養(yǎng)24h同步化，利用脂質(zhì)體(TransFast Transfection Reagent)介導(dǎo)，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pReceiver-M29-Lipocalin2及空載體pReceiver-M29瞬時轉(zhuǎn)染入人腎近曲小管上皮細胞中，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察Lipocalin2基因在人腎近曲小管上皮細胞中的表達和定位情況。 結(jié)果： 1、融合表達載體pReceiver-M29-Lipocalin2構(gòu)建情況：限制性內(nèi)

5、切酶NSP Ⅴ和Xho Ⅰ酶切重組質(zhì)粒及DNA測序結(jié)果都說明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒為pReceiver-M29-Lipocalin2融合表達載體。 2、Lipocalin2基因在人腎近曲小管上皮細胞中定位情況：瞬時轉(zhuǎn)染人腎近曲小管上皮細胞后激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，pReceiver-M29轉(zhuǎn)染的細胞和pReceiver-M29-Lipocalin2轉(zhuǎn)染的細胞熒光布局不同：pReceiver-M29空載體轉(zhuǎn)染的細胞熒光均勻分布在整個細

6、胞中，而pReceiver-M29-Lipocalin2融合表達載體轉(zhuǎn)染的細胞熒光主要集中在細胞漿中。 結(jié)論：成功構(gòu)建pReceiver-M29-Lipocalin2融合表達載體。瞬時轉(zhuǎn)染到人腎近曲小管上皮細胞后，重組載體可在活細胞中表達而沒有細胞毒性，且具有自發(fā)綠色熒光的特點，可在人腎近曲小管上皮細胞中觀察Lipocalin2基因的表達和定位情況，為進一步探索Lipocalin2基因在人腎近曲小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化和/或逆轉(zhuǎn)分化中