熒光蛋白文庫(kù)構(gòu)建及FRET技術(shù)篩選鈣調(diào)素結(jié)合蛋白.pdf

1、Ca2＋是細(xì)胞中普遍存在的第二信號(hào)分子，它調(diào)控許多不同的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖，發(fā)育，遷移，分泌，學(xué)習(xí)和記憶。鈣調(diào)素（CaM）是細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的主要受體，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等過(guò)程中都起著重要作用。由于CaM 本身并不具有任何酶活性，其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵在于它能夠和鈣調(diào)蛋白效應(yīng)因子結(jié)合，引起這些效應(yīng)因子生物學(xué)活性的改變，進(jìn)而參與生命活動(dòng)的調(diào)控。
　　 因此，研究鈣調(diào)蛋白效應(yīng)因子有助于進(jìn)一步揭示CaM的生理功能。為

2、了更好地研究CaM在細(xì)胞周期調(diào)控中的重要作用，就要試圖找到CaM在周期細(xì)胞中的下游效應(yīng)因子。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型大規(guī)模篩選CaM 結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)。
　　 我們通過(guò)Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)帶有CFP 熒光蛋白標(biāo)記的文庫(kù)，與YFP-CaM 共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）檢測(cè)。如果發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移并且計(jì)算結(jié)果在可信范圍內(nèi)，則認(rèn)為與CaM 發(fā)生相互作用。利用膜片鉗微電極玻璃毛細(xì)管吸取發(fā)生FRET

3、的單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞PCR。
　　 測(cè)序擴(kuò)增出的片段，通過(guò)與已知蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得出與CaM 相互作用的蛋白。通過(guò)這種手段我們可以篩選出未知的與CaM 相互作用的蛋白，從而為進(jìn)一步研究CaM 蛋白在生理環(huán)境下的作用提供條件。甚至，我們可以利用這個(gè)方法篩選任意兩種相互作用的蛋白，從而豐富了大規(guī)模篩選的方法。目前我們已經(jīng)通過(guò)這種方法成功的篩選到了一些與CaM 相結(jié)合的蛋白。從而成功確立這一新的大規(guī)模篩選CaM 結(jié)合蛋白的方