利用新型人源打靶載體構(gòu)建基因定點(diǎn)修復(fù)的熒光報(bào)告系統(tǒng).pdf

1、理想的基因治療應(yīng)該具備以下三方面的要求:基因治療的有效性、基因治療的靶向性和基因治療的安全性.近年來出現(xiàn)的寡核苷酸介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修復(fù)策略,可針對(duì)基因位點(diǎn)的缺陷進(jìn)行原位矯正,使修復(fù)的基因能夠在其本身的染色質(zhì)環(huán)境和調(diào)控序列調(diào)節(jié)下進(jìn)行適宜水平的表達(dá),是基因治療的理想模式,具有比傳統(tǒng)策略更明顯的優(yōu)越性.從寡核苷酸修復(fù)術(shù)的發(fā)展過程考慮,本文建立一種靈敏、方便、穩(wěn)定、可靠的報(bào)告系統(tǒng).實(shí)驗(yàn)證明,本系統(tǒng)直接、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定了定點(diǎn)修復(fù)事件的發(fā)生,結(jié)果穩(wěn)

2、定,為機(jī)制研究建立了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái).在本系統(tǒng)研究中,發(fā)現(xiàn)寡核苷酸的作用表現(xiàn)出明顯的鏈偏向性,即針對(duì)正義鏈的打靶分子起效,而與之互補(bǔ)的另一條打靶分子幾乎沒有修復(fù)作用,支持了Kmiec和Yoon等人提出的SSO作用的轉(zhuǎn)錄相關(guān)因素.結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究所發(fā)現(xiàn)的提高效率的復(fù)制相關(guān)因素,我們認(rèn)為寡核苷酸的定點(diǎn)修復(fù)作用是包括轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)等與細(xì)胞功能密切相關(guān)的多因素、多環(huán)節(jié)共同參與、作用的結(jié)果,不能簡(jiǎn)單用一種機(jī)制解釋.本實(shí)驗(yàn)室曾發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫代修飾

3、的SSO修復(fù)后發(fā)光細(xì)胞喪失了正常的分裂能力而無(wú)法獲得糾正后的細(xì)胞克隆,因此我們利用新獲得的細(xì)胞系繼續(xù)對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了觀察,初步判斷了SSO的修復(fù)對(duì)細(xì)胞分裂能力的影響.在有效提高寡核苷酸介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修復(fù)效率的基礎(chǔ)上,下一步的工作中,我們將利用AS-PCR、PCR-RFLP、DNA測(cè)序、Southern blot、Westernblot等多種檢測(cè)方法,從多水平驗(yàn)證靶位點(diǎn)的特異性改變,在該實(shí)驗(yàn)平臺(tái)基礎(chǔ)上,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期工作,進(jìn)行更加完整而