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1、該研究的目的是擴增出PTH的完整編碼序列,構(gòu)建該基因的表達(dá)載體質(zhì)粒.根據(jù)國外已報道的甲狀旁腺激素(PTH)基因序列,應(yīng)用OLIGO4.0設(shè)計引物,并在引物中引入兩個酶切位點(EcoRI、XbaI).以從人胚甲狀旁腺組織中提取的mRNA作為模板,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增出一條大小約270bp的cDNA片段,將該基因片段經(jīng)EcoRI、XbaI兩個限制性內(nèi)切酶消化后,插入到pCR3.1載體上,經(jīng)大腸桿菌JM109感受態(tài)轉(zhuǎn)化后
2、,篩選獲得含插入片段的重組表達(dá)質(zhì)粒(pCR3.1·PTH).對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定及序列分析.結(jié)果表明陽性重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增,可以獲得與PTH基因大小相符的片段,約270bp;另外,經(jīng)EcoRI、XbaI雙酶切鑒定,也可得到270bp和5000bp大小的兩條帶.由此可以推斷目的基因片段已經(jīng)克隆到pCR3.1載體上.將pCR3.1·PTH中的插入片段測序及序列分析,證明該插入片段為PTH基因.這項工作的完成為甲狀旁腺機能減退癥(HPT)
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