利用鋅指酶提高人源基因載體打靶效率的初步研究.pdf

1、背景：基因治療是指通過(guò)一定的方法將外源DNA分子導(dǎo)入病人體細(xì)胞并有效表達(dá)，從而糾正缺陷性狀和表型，達(dá)到治療疾病的目的。目前應(yīng)用于基因治療的的載體主要包括病毒載體和非病毒載體兩大類(lèi).病毒載體和非病毒載體都具有各自的優(yōu)勢(shì)，被廣泛的應(yīng)用。病毒載體相對(duì)于非病毒載體具有高效的特點(diǎn)。但是病毒載體具有免疫原性和隨機(jī)整合等安全性問(wèn)題，因此非病毒載體相對(duì)來(lái)說(shuō)具有獨(dú)特的安全性優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)室所開(kāi)發(fā)研究的“人源基因載體pHrneo”是一種非病毒載體，前期的臨床

2、前研究證實(shí)其可能是一種應(yīng)用于基因治療的有效的打靶載體，但其打靶效率仍有待進(jìn)一步提高。鋅指酶是一種人工嵌合酶，它能夠通過(guò)在基因組的特定位點(diǎn)制造DNA雙鏈斷裂刺激細(xì)胞內(nèi)同源重組，使打靶效率提高5000倍以上，它可能是一種提高人源基因打靶載體打靶效率的有效的工具。 目的：建立體外快速設(shè)計(jì)鑒定有效鋅指酶的系統(tǒng)；設(shè)計(jì)鑒定出能有效切割位于h rDNA區(qū)的打靶位點(diǎn)的鋅指酶，為進(jìn)一步應(yīng)用于提高人源基因載體打靶效率打下基礎(chǔ)。 方法：1、本

3、研究選擇了3個(gè)打靶位點(diǎn)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)了4組鋅指酶(8個(gè)鋅指酶單體)；2、利用OVER-LAP PER的方法合成鋅指酶基因，并構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體；3、通過(guò)TNT-T7快速轉(zhuǎn)錄翻譯試劑盒快速翻譯鋅指酶蛋白，通過(guò)與含有靶向位點(diǎn)的DNA質(zhì)粒載體作用，應(yīng)用體外兩步法進(jìn)行鋅指酶有效性鑒定；4、將所設(shè)計(jì)的鋅指酶表達(dá)載體與phr-GFP轉(zhuǎn)染HEK293-T及HL7702細(xì)胞，觀察熒光表達(dá)效率以及細(xì)胞毒性。 結(jié)果：1、通過(guò)體外快速鑒定，