攜帶抑菌基因IL-24的rDNA區(qū)靶向載體對(duì)MSCs打靶的初步探索.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人類對(duì)于DNA重組技術(shù)的認(rèn)識(shí)逐漸成熟，腫瘤基因治療作為治療腫瘤的新手段應(yīng)運(yùn)而生。在腫瘤基因治療中，載體以及運(yùn)輸細(xì)胞的選擇尤為關(guān)鍵。我室一直致力于安全，高效的非病毒載體的研究與開(kāi)發(fā)，在前期研究中已經(jīng)成功構(gòu)建了針對(duì)腫瘤基因治療的載體:pHrneo-IL24。在靶細(xì)胞的選擇上，MSCs具有向腫瘤位置遷移和趨近的能力，并且易于分離，可分化為多種細(xì)胞，有報(bào)道表明MSCs已應(yīng)用于腫瘤治療的臨床前試驗(yàn)。MSCs的靶向基因修飾可進(jìn)

2、一步促進(jìn)其在腫瘤基因治療中的療效，但MSCs的基因修飾一直是個(gè)技術(shù)難題，靶向基因編輯技術(shù)——核酸工程酶TALEN的出現(xiàn)為突破此難題提供了良好的工具。因此，本研究擬結(jié)合TALENickases（我室已建立的TALEN高效突變體），利用攜帶IL-24的核糖體基因區(qū)靶向載體pHrneo-IL24對(duì)MSCs進(jìn)行基因打靶，以期得到穩(wěn)定表達(dá)有生物學(xué)活性IL-24蛋白的定點(diǎn)整合克隆。
　　目的:使用pHrneo-IL24載體系統(tǒng)聯(lián)合TALENi

3、ckases打靶MSCs，以期得到穩(wěn)定表達(dá)IL-24的MSC細(xì)胞株。
　　方法:1.MSCs的分離與培養(yǎng):從骨髓標(biāo)本中分離骨髓中的單核細(xì)胞，再用貼壁培養(yǎng)分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。2.流式鑒定擴(kuò)大培養(yǎng)的MSCs表面標(biāo)志物。3.將TALENickases以及pHrneo-IL24質(zhì)粒通過(guò)核轉(zhuǎn)，共轉(zhuǎn)染至MSCs，鏡下通過(guò)觀察融合的GFP蛋白表達(dá)，分析轉(zhuǎn)染效率。4、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分兩線接種，一線加入G418篩選定點(diǎn)整合克隆，另一線直

4、接擴(kuò)增培養(yǎng)。5.抽提打靶后細(xì)胞gDNA，定點(diǎn)整合PCR鑒定rDNA區(qū)整合細(xì)胞。6.收集打靶后細(xì)胞上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞克隆IL-24蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果:1.從骨髓標(biāo)本中分離出的MSCs呈短梭形，形態(tài)規(guī)整，數(shù)次傳代后，呈成纖維狀，流式結(jié)果顯示符合MSCs的各項(xiàng)表面標(biāo)志物表達(dá);2.核轉(zhuǎn)后的MSCs鏡下可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)，G418篩選后的細(xì)胞大量死亡，未得到定點(diǎn)整合的單克隆細(xì)胞。3.擴(kuò)增未加G418篩選的轉(zhuǎn)染后MSCs，抽提gDN