利用精子載體法制備LTF轉(zhuǎn)基因山羊的初步研究.pdf

1、精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是以精子為載體，在受精時(shí)將外源目的基因?qū)肼涯讣?xì)胞，是目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中簡單而高效的方法學(xué)之一。乳鐵蛋白(LTF)也稱為乳轉(zhuǎn)鐵蛋白,是一種鐵結(jié)合蛋白，廣泛分布于多種組織、細(xì)胞內(nèi)，具有非特異性免疫、參與鐵代謝和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)等功能。研究了在精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移過程中精子與外源結(jié)合的影響因素，并對利用精子載體法制備LTF轉(zhuǎn)基因山羊進(jìn)行了初步研究。 精子與外源DNA共孵育后，精子結(jié)合外源DNA的效率就成為精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因法成

2、功的關(guān)鍵。以DIG標(biāo)記的EGFP作為示蹤基因來檢測精子結(jié)合外源DNA的影響因素，用考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)評價(jià)精子的頂體反應(yīng)。結(jié)果顯示：山羊精子能夠自發(fā)的結(jié)合外源DNA，而且，最初的結(jié)合部位在精子外膜的頂體后區(qū)，在檢查的27只公羊樣本中，結(jié)合率在3.2％-48.40％，不同供體的精子結(jié)合外源DNA的能力有顯著差異(p<0.01)。同一山羊的精子分別在17℃、27℃、37℃條件下，與外源DNA共孵育。結(jié)果表明：精子與外源DNA的結(jié)合率隨共孵育時(shí)

3、間的延長而增加。在27℃和37℃下，孵育60分鐘后的結(jié)合率不再增加，同樣的結(jié)果出現(xiàn)在17℃處理了90分鐘的試驗(yàn)組里。為獲得高轉(zhuǎn)染率，分別對EGF、Insulin,肝素和ITS四種因子對精子結(jié)合外源DNA的影響也進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果表明：用添加10 ng/ml EGF的BO液能顯著提高轉(zhuǎn)染率(試驗(yàn)組30.5％，對照組19.4％)，但精子獲能的比率變化不大。相似的結(jié)果出現(xiàn)在Insulin和肝素處理的組里。用ITS的最終濃度(0.5％-5％)評價(jià)

4、其促進(jìn)DNA與精子的結(jié)合能力。在0.5％ITS組，試驗(yàn)組(0.5％，16.2％；1％，12.0％；2％，9.5％；5％，9.4％)和對照組(21.9％)外源DNA的轉(zhuǎn)染率顯著不同。精子獲能率在5％ITS試驗(yàn)組和對照組差異顯著(64.7％vs.86.2％)，但其他試驗(yàn)組差異不顯著(0.5％，87.9％；1％，85.7％；2％，82.7％)。此外，EGF(10 ng/ml)、Insulin(5 ug/ml)和肝素(10 ug/ml)對DNA

5、轉(zhuǎn)染的比率也進(jìn)行了評價(jià)，試驗(yàn)組和對照組有明顯差異(27.9％VS.19.3％)(p<0.05)。然而，BO液添加LipefectaminTM-2000抑制三個(gè)因子對山羊精子轉(zhuǎn)染外源DNA的促進(jìn)作用(22.1％VS.27.9％)(p<0.05)。對70只母羊進(jìn)行同期發(fā)情處理，其中有26只發(fā)情，發(fā)情率為37.1％。精子與LTF基因共孵育后，對62只母羊進(jìn)行人工授精，共產(chǎn)生后代26只，經(jīng)過PCR檢測LTF陽性后代有2只，陽性率為7.7％，試驗(yàn)