逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體制備轉(zhuǎn)基因雞的初步研究.pdf

1、為了建立更加完善的逆轉(zhuǎn)錄病毒法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞的技術(shù)體系。本研究選用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)為外源基因（亦為報(bào)告基因）、pEASY-T3為克隆載體、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)為骨架的puro-pBabe質(zhì)粒為表達(dá)載體、含有皰疹性口腔炎病毒G蛋白基因的pVSV-G質(zhì)粒為包裝載體、23910A1細(xì)胞為包裝細(xì)胞。在PCR擴(kuò)增出EGFP基因序列的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建克隆載體pEASY-T3-EGFP和重組表達(dá)載體puro-pBabe-E

2、GFP。采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法與競(jìng)爭(zhēng)包裝法相結(jié)合的方法將puro-pBabe-EGFP與包裝載體pVSV-G共同轉(zhuǎn)入23910A1細(xì)胞中以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒原液經(jīng)滴度檢測(cè)后，采用低溫超速離心的方法濃縮200倍。濃縮病毒液以注射的方式導(dǎo)入雞胚的囊胚下腔進(jìn)行原始生殖細(xì)胞(PGCs)的雞胚內(nèi)轉(zhuǎn)染，然后將雞胚置于孵化箱中進(jìn)行孵化。待孵化5.5d時(shí)，隨機(jī)選取試驗(yàn)雞胚，提取其全胚基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。其結(jié)果為:
　　1)克隆載體的PCR鑒定結(jié)果以

3、及測(cè)序結(jié)果與理論序列的比對(duì)結(jié)果表明，已成功構(gòu)建出與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致的克隆載體pEASY-T3-EGFP;
　　2)表達(dá)載體的PCR鑒定結(jié)果、測(cè)序結(jié)果與理論序列的比對(duì)結(jié)果以及表達(dá)載體瞬轉(zhuǎn)入胎牛中腎成纖維細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果表明，已成功構(gòu)建出與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致并且具有體外表達(dá)EGFP活性的重組表達(dá)載體puro-pBabe-EGFP;
　　3)由病毒原液的滴度測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算出試驗(yàn)得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度為2.3×105/ml，結(jié)果表明采用磷

4、酸鈣轉(zhuǎn)染法與競(jìng)爭(zhēng)包裝法相結(jié)合的方法包裝出高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒;
　　4) PCR檢測(cè)雞胚基因組DNA整合EGFP基因的結(jié)果為，有75％的雞胚呈陽性;在PCR檢測(cè)基礎(chǔ)上進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)，結(jié)果有66.7％的雞胚呈陽性。表明包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)將EGFP基因整合到基因組中，同時(shí)也證明了以MoMLV為骨架的轉(zhuǎn)錄病毒載體可感染不同物種來源的細(xì)胞。
　　綜上所述，本研究結(jié)果不僅為采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法制備轉(zhuǎn)基因雞提供了可行性依據(jù)，