k—ras突變基因的克隆及逆轉(zhuǎn)錄病毒pegz／mcsha載體的構(gòu)建

1、1 4 4S U Z H O UUN I V E R S I T YJ O U R N A LO FME DI C A LS C I E N C E2 0 0 4 ； 2 4 ( 2 )K — r a s突變基因的克隆及逆轉(zhuǎn)錄病毒 p E G Z ／ MC SH A載體的構(gòu)建 楊波，何 楊，吳翼偉，張志德 ( 蘇州大學(xué) 附屬第一醫(yī)院， 江蘇 蘇州 2 1 5 0 0 6 )摘要 ： 目的 克隆 K ． r a s 癌基因， 測(cè)定其序列及

2、突變類型， 構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。方法 通過逆轉(zhuǎn)錄一 聚合 酶鏈?zhǔn)?反 應(yīng) ( R T — P C R ) 方法 從 胰腺 癌 細(xì)胞 株 中克隆 K — r a S 基因 ， 與 T ． V e c t o r 載 體 連接 后測(cè) 序 。構(gòu) 建含 K — r a s 基 因 的 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。結(jié)果 胰腺癌細(xì)胞株 B x p c ． 3 、 S w1 9 9 0 未及點(diǎn)突變， P a t u 8 9 8 81 2位密碼子 的 G G

3、T突變?yōu)?G T T ，1 3 、 6 1 位無突變。酶切證明逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。結(jié)論 K ． r a s 癌基 因的成功克隆及逆轉(zhuǎn)錄病 毒表達(dá)載 體的構(gòu)建， 為胰腺癌的免疫治療研究奠定了基礎(chǔ) 。關(guān)鍵詞 ： 胰腺癌 ；K ． r a s 基因；R T ． P C R ；基因序列；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 中圖分類號(hào) ： R 3 9 4 ． 4 ；R 7 3 6 ． 7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： A 文章編號(hào) ： 1 0 0 0 — 5 7 4 9

4、( 2 0 0 4 】 0 2 —0 1 4 4 — 0 3Th eCl o n eo ft h eK— r a sOn c o g e n ea n dCo n s t r u c t i o no fRe t r o v i r a lVe c t o rp EGZ／ M CSHA Y AN G Bo， HE Ya n g， W U Yi — we i ， e ta l( T h eF i r s tH o s p i t a

5、 lA f f i l i a t e dt OS u z h o uUn i v e r s i t y ， J i a n g s uS u z h o u2 1 5 0 0 6 ，C h i n a )A b s t r a c t ： 0b j e c t i v eT oc l o n eK— r a so n c o g e n e ， d e t e c t i v ei t smu t a t i o na n dc o

6、 n s t r u c tr e t r o v i r a lv e c —t o r ．M e t ho d sTh e r ewa ss p e c i a le x p r e s s i o no fK— r a so n c o g e n ep o i n tm u t a t i o ni np a n c r e a t i cc a n c e r ， K—r a so n c o g e n ewa sc o l

7、 o n e df r o m p a n c r e a t i cc a n c e rl i n eB x p c 一 3、 S w 1 9 9 0 、 P a t u 8 9 8 8b yu s i n gRT— P CR me t h o d ． Byme a n so fT— A e x t e n s i o nc l o n i n g ， t h eg e n ewa sl i g a t e dwi t hT—

8、 Ve c t o ra n ds e q u e n c e d． Toc o n s t r u c tr e t r o v i r a lv e c t o rc o n s t i s t i n go fK— r a so n c o g e n e ．Re s u l t sTh e r ewe r en o n eo fp o i n tmu t a t i o ni np a n c r e a t i cc a n

9、c e rl { n eBx p c 一 3、 S w 1 9 9 0a n d1 3 t h、 6l t hp o i n tm u t a t i o ni nP a t u8 9 8 8．W ef o u n dGGT — GTT i n1 2t hc o d o ni nP a t u8 9 8 8l i n e ． Ac c o r d i n gt ot h ed o u b l ed i g e s t i o n ，i

10、 twa sc o m f i r m e dt h a tr e t r o v i r a lv e c t o rc o n s t i s t i n go fK— r a so n c o g e n eh a db e e nc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y．Co n c l u s i o nTh es u c c e s s f u lc l o n eo fK—

11、r a so n c o g e n ea n dc o n s t r u c t i o no fr e t r o v i r a lv e c t o rl a y st h ef o u n d a t i o nf o rt h ei m—mu n o t h e r a p yo fp a n c r e a t i cc a n c e r ．Ke ywo r d s ： p a n c r e a t i cc a n

12、 c e r ； K— r a so n c o g e n e ； RT— P CR； g e n es e q u e n c e ； r e t r o v i r a lv e c t o rK — r a s 癌基 因在胰腺 癌 中有特 異性 表達(dá)， 主要 以密碼 子的點(diǎn)突變?yōu)橹?。為進(jìn)一步進(jìn)行胰腺癌 的免疫 治療研 究， 我 們采 用 R T — P C R方法 從胰 腺癌 細(xì)咆 株 中克隆 K — r a s 癌基 因，

13、采 用 T — A 克隆 法測(cè) 定 其 序列 及突變類 型， 采 用雙 酶 切法 構(gòu) 建 含 K — r a s 癌基 因的 逆轉(zhuǎn) 錄病毒 p E G Z ／ MC SH A載體 ?，F(xiàn)報(bào)道 如下。1 材料與方法 1 ． 1材 料 胰 腺 癌 細(xì) 胞 株 B x p c 一 3 、 S w1 9 9 0 、 P a t u8 9 8 8 由上海長海 醫(yī)院 許 國銘教 授 惠贈(zèng) 。U u i q 一 1 0柱 式總 R N A抽提試劑盒，

14、MML V第一鏈 c D N A合成試劑盒 ， P C R 擴(kuò)增 試 劑 盒， Uu i q - 1 0柱 式 D N A 膠 回收試劑 盒， Uu i q 一 1 0柱 式質(zhì)粒 小 量抽 提 試劑 盒 ， P C R產(chǎn)物 克隆試劑 盒 ， 限制 性 內(nèi)切酶 B a mHI、 H i n d Ⅲ，R P MI 1 6 4 0培 養(yǎng)液購 自上海生 工生 物工程 技術(shù) 服務(wù) 有 限公司 。流 式細(xì)胞儀 ( E P I C SA L T R

15、A ) 購 自美 國 收稿日期 ： 2 0 0 3— 0 9— 2 6 作者簡介： 揚(yáng) 波( I 9 7 1 一) ， 江蘇常卅 f ， 、 ， 另州大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 主治醫(yī)師， 在讀醫(yī)學(xué)博士， 研究方向?yàn)橄滥[瘤 的 免疫治療 維普資訊 http://www.cqvip.com 1 4 6S U Z H O UUN I V E R S I T YJ O UR N A LO FME D I C A LS C I E N C E2 0

16、 0 4 ； 2 4 ( 2 )A ． 陰性 對(duì)照 正常 L 9 8 9細(xì)胞 B ． K - r a s l 2位突 變 ( V a D 陽性表 達(dá) 圖 2流式細(xì)胞儀測(cè)定 K — r a s ] 2 位突變( V a 1 ) 在 鼠成纖維母細(xì)胞 L 9 2 9的表達(dá) 2 1k d的單聚體 G蛋 白， 通過 與 G T P ／ G D P結(jié) 合 ， 調(diào) 節(jié)細(xì)胞 蛋 白的翻譯 及 核酸 的轉(zhuǎn) 錄? 。K — r a s 基 因突 變主要

17、為 1 2 、 1 3 、 6 1位 的 點(diǎn) 突變 。胰 腺 癌 患 者 中，K — r a s 基 因突變達(dá) 到 7 0 ％～1 0 0 ％J ， 其 活化 的突變 為腫瘤 發(fā)生中相 當(dāng)早 期 的事 件。其 中 以 1 2位 密碼 子的 點(diǎn) 突 變 頻 率 最 高， 可 見 G G T 突 變 為 G A T 、G T T 、 C G T 、 T G T ， 表現(xiàn)為 K — r a s 蛋白 1 2 位甘氨酸被天冬氨酸 、 纈氨酸 、

18、 精氨 酸 、 半胱 氨酸等替代 ] 。由于 K — r a s 基 因在 胰腺 癌 中突 變 發(fā)生 早， 突 變 率高， 突變位 點(diǎn) 固定。表達(dá) 產(chǎn) 物 由于 一級(jí)結(jié) 構(gòu) 發(fā)生 變化從而引起 其 功能 發(fā) 生 改變 ， 使 K— r a s 突變 蛋 白能成為免疫 治療 的潛 在靶點(diǎn) l 4 ] 。我們 通 過 R T ． P C R 方 法 ， 從癌 細(xì) 胞 株 總 R N A中克隆 K — r a s 基 因， 通 過 測(cè) 定其

19、序 列 來 了解 其 突變 的類型 。研 究表明 ： 利 用靶 基 因的 特異 序列 為模板 合成 的反 轉(zhuǎn)錄 引物 能 有效 地 擴(kuò)增 目的 基 因， 較 O l i —g o — p ( d T ) l 8 P r i me r 為引物逆 轉(zhuǎn)錄 擴(kuò)增 有較 高的特 異 性 。從測(cè)序結(jié)果看 ， 與 G e n e B a n k中正 常 K— r a s 基因序列 進(jìn)行 比較 ， B x p c 一 3和 S w 1 9 9 0未 及

20、 K— r a s 基 因的點(diǎn) 突變 ， 其 1 2 、 1 3 、 6 1位 密 碼 子 分 別 為 G G T、G G C 、 C A A， 轉(zhuǎn)錄氨基酸對(duì)應(yīng) 為甘氨酸( G l y ) 、 甘氨酸 ( G l y ) 、 谷 酰氨 酸 ( G i n ) 。P a Tu 8 9 8 8株 1 2 、 1 3 、 6 1應(yīng) 密碼子 為 G T T、 G GC 、 C A A， 轉(zhuǎn)錄 氨基酸 對(duì)應(yīng)為纈 氨 酸 ( Va 1 ) 、 甘

21、氨 酸 ( G l y ) 、 谷 酰 氨 酸 ( GI n ) 。 在 P a T u 8 9 8 8細(xì) 胞 株 中 出 現(xiàn) K — r a s 基 因 1 2位 的 點(diǎn) 突 變 ， 所表達(dá) 的 K — r a s 蛋 白 中含有 不 同 于正 常 原癌 蛋 白的多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu) ， 提供 了潛在的異常抗 原位點(diǎn) 。使我 們針對(duì)胰腺癌進(jìn)行 以 K — r a s 突變蛋 白為靶 點(diǎn)的 免疫治療研 究成 為 可能 。在 此基 礎(chǔ) 上， 我

22、 們構(gòu) 建含 K — r a s 基 因逆 轉(zhuǎn) 錄病 毒 p E G Z ／ MC SH A 載 體， 能有 效地表達(dá) 正常 K — r a s 蛋 白及突變蛋 白( 1 2位 ： 甘氨酸 一 纈 氨酸) ， 為研 究胰腺 癌的免疫治療奠定 了基礎(chǔ)。參考 文 獻(xiàn) ：[ 1 ] L o w yD R ， Wi l l u m s e nB M． F u n c t i o na n dr e g u l a t i o no fr a s

23、[ J ] ． A n n uR e vB i o c h e m，1 9 9 3 ， 6 2 ： 8 5 1 ～8 9 I ．[ 2 ]Ma r i y a m aM， K i s h iK ，N a k a mu r aK ，e ta 1 ． F r e q u e n c ya n dt y p e so fp o i n tmu t a t i o na tt h e1 2 t hc o d o no ft h ec - k i

24、 —r a sg e n ef o u n di np a n c r e a t i cc a n c e r sf o r m j a p a n e s ep a —t i e n t s [ J ] ． J p nJC a n c e rR e s ， 1 9 8 9 ， 8 0 ： 6 2 2 ～6 2 6 ．[ 3 ] H r u b a nR H， V a nMa n s f e l dA D ， O f f e r h

25、 a u sG J ， e tn ￡ ． K —r a so n c o g e n ea c t i v a t i o ni na d e n o c a r c i n o m ao ft h eh u ma np a n c r e a s ． A s t u d yo f8 2c a r c i n o m a su s i n gac o mb i n a t i o no fm u t a n t · - e

26、n r i c h e dp o l y m e r s ec h a i nr e a c t i o na n a l y s i sa n da l · -l e l e s p c c i f i co l i g o n u c l e o t i d eh y b r i d i z a t i o n [ J] ．A mJPa t h o l ， 1 9 9 3， 1 4 3： 5 4 5～ 5 5 4．[ 4

27、] P e a c eD J ， C h e nW， N e l s o nH， e tn ￡ ． Tc e l lr e c o g n i t i o no ft r a n s f o r m i n gp r o t e i n se n c o d e db ym u t a t e dr a sp r o t o - o n c o —g e n e s [ J ] ． Jl m m u n o l ，1 9 9 1 ， 1