基因定點(diǎn)突變提高人醇脫氫酶ADH2蛋白酶活性的研究.pdf

1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文基因定點(diǎn)突變提高人醇脫氫酶ADH2蛋白酶活性的研究姓名：王旭達(dá)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：李景鵬20080620A b s t r a c tI m p r o v e t h eA c t i v i t yo f t h eH u m a n A l c o h o lD e h y d r o g e n a s e 2 b y A p p l y i n g t h eS i t e —d

2、i r e c t e dM u t a g e n e s i sA b s t r a c tA l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( A D H ) i Sam e t a l l i ce n z y m e w h i c hc o n t a i n sz i n c ．I t i S m o s tn o t e da sb e i n g t h e e n z y m ep r

3、i m a r i l y r e s p o n s i b l e f o r c a t a l y z i n g t h e f i r s t r e a c t i o n i n t h e m e t a b o l i s mo fe t h a n 0 1 ．S t u d y i n g o nA D H p l a y s a ni m p o r t a n t r o l e i n p r o t e c

4、 t i n g a g a i n s t d a m a g eo f l i v e r t i s s u ea r o u s e db y a l c o h 0 1 ．A D Hs h o w ni t sg r e a tp o t e n t i a lf o rd e v e l o p i n ga n dr e s e a r c h i n gt h ep r o d u c to fa n t i a l c

5、 o h o l i s m a n d p r o t e c t i n g l i v e r ．W i t hr a p i d d e v e l o p m e n to f t h e s i t e —d i r e c t e d m u t a g e n e s i st e c h n i q u e ，p e o p l ec a i la c h i e v et h ea i m a tc h a n g

6、i n g t h es t r u c t u r e a n d f u n c t i o no fp r o t e i nb y a p p l y i n gt h ．e s i t e —d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ．R e s i d u e n e a rt h ea c t i v ec e n t e ro fA D H 2 r e s t r i c t si t s

7、a p p l i c a t i o n ，S Ot h er e p l a c e m e n t o f t h et a r g e ts i t e w o u l de n l a r g e t h e p o c k e ta n dc h a n g et h e s p e c i f i c i t ya n d a f f i n i t y o ft h es u b s t r a t e ，a n d t

8、 h ea c t i v i t yo fA D H 2 c a nb ei m p r o v e do b v i o u s l y ．W ec h a n g e dt h eA D H 2 g e n eo v e rt h em e g a p r i m e rP C R m e t h o d ．T h r e ep r i m e r sw e r es y n t h e s i z e d ．o n ew a s

9、ap r i m e rw i t h t h en e e d e dm u t a t i o n ；t h eo t h e rt w o c o n t a i n i n ga p p r o p r i a t ee n z y m e s i t e sf o rc o n s t r u c t i o no ft h eP C R f r a g m e n ti n t oa s u i t a b l ep l a

10、 s m i dw e r e l o c a t e da t t h e f l a n k s o ft h em u t a t i o np r i m e r ．A f t e rt h ea m p l i f i c a t i o no ft h eP C Rf r a g m e n tu s i n g t h e m u t a t i o np r i m e ra n d t h er e v e r s e

11、f l a n k i n gp r i m e r , a n o t h e rP C R w a sp e r f o r m e du s i n g t h ep r e v i o u sP C R m u t a t i o ns e g m e n ta sp r i m e ra n dt h eo t h e rf l a n k i n gp r i m e r ．A s a r e s u l t ，t h ep

12、 o i n tm u t a t i o n s h a db e e nc o m p l e t e ds u c c e s s f u l l y ．T h ep h e n y l a l a n i n eo f t h e9 4 t ha m i n oa c i dw a sr e p l a c e db y a l a n i n e ，a n dt h et h r e o n i n eo f t h e3 7

13、 1 s ta m i n o a c i dw a s r e p l a c e db yc y s t e i n e ．A D H 2 w a s r e c o m b i n e d w i t hp T Y B l l v e c t o r a tE c o R I a n d X h o I s i t e s ，a n dr e c o m b i n a n tD N A( p r o k a r y o t i

14、cs y s t e m ) w a st r a n s f o r m e di n t o E R 2 5 6 6 ．T h e r e s u l t o ft h e b e s ti n d u c e d e x p r e s s i o ni n d i c a t e st h a t t h eh u m a nA D H 2 f u s i o np r o t e i ni S i n d u c e db y

15、0 ．3 m m o l ·L ．‘I P T Gf o r4 ha t 1 6 ℃．A f t e r t h ep o s i t i v e r e c o m b i n a n ts c r e e n e dw a si n d u c e d a t t h e b e s tc o n d i t i o n ，A D H 2w a sg o ta n de x p r e s s e da c c o u n

16、 t e df o r1 5 ．8 5 ％o ft o t l ep r o t e i n s ．，R e c o m b i n a n tA D H 2w a s p u r i f i e db yI M P A C T T M ．C NP r o t e i n P u r i f i c a t i o n S y s t e m a n d t h em o l e c u l a rw e i g h t s o ft

17、h et a r g e tp r o t e i n sw e r e 4 0 K D ．D u r i n g t h em e n s u r a t i o n o ft h ec o n c e n t r a t i o n so f p u r i f i e dp r o t e i n s ，w eg o t p r o t e i nw i t h t h ec o n c e n t r a t i o na b

18、o u t 0 ．2 5 ～0 ．3 3m g ‘m L l ．T h ee n z y m ea c t i v i t i e so fh u m a nA D H 2 w a sd e t e c t e db yb e i n gm o n i t o r e dt h eA 3 4 0 n mv a l u e sa t2 5 ℃i n0 ．1 m o l ·L - 1s o d i u mp h o s p h a

19、 t e ，p H7 ．5 ．W ec a l c u l a t e d i t s a c t i v i t yw i t hY A D H a ss t a n d a r dp r o t e i n ，t h ea c t i v i t yo fA D H 2 w a s8 ．9 U 。m g - 1 , o b v i o u s l y , t h ea c t i v i t yo fA D H 2 h a db e