鋅指基因ZFP580-ZNF580在GDF-15影響缺血再灌注后無復流中的作用及機制研究.pdf

1、目的：無復流是目前臨床PCI術(shù)后發(fā)生率較高的一種現(xiàn)象，與多種不良預后密切相關(guān)，可嚴重降低再灌注治療效果。生長分化因子-15(Growthdifferentialfactor-15，GDF-15)作為轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族中的一員，不僅在細胞的生長、分化、增殖過程中發(fā)揮重要作用，而且與細胞的凋亡和死亡也有密切關(guān)系，參與多種病理生理過程，且與無復流現(xiàn)象密切相關(guān)，已成為國際研

2、究熱點。GDF-15在多種研究中被確認為一種應激反應性蛋白，可通過PI3K/Akt、ERK1/2等信號途徑降低缺血再灌注損傷和炎癥反應，發(fā)揮心臟保護作用。然而GDF-15是否可降低無復流損傷以及通過哪些靶分子降低無復流目前尚不清楚。ZNF580是由本組篩選人主動脈cDNA文庫得到的一種新型C2H2鋅指蛋白基因，ZFP580是本組隨后克隆的人ZNF580的鼠源性同源基因。前期研究發(fā)現(xiàn)ZFP580作為一個重要的核轉(zhuǎn)錄因子，由ERK1/2信號

3、通路介導從而減少心肌細胞凋亡，起到保護心臟的作用；且ZFP580可通過TGFβ/ALK5/Smad2通路調(diào)節(jié)eNOS表達和內(nèi)皮細胞增殖、遷移，并參與H2O2誘導的ROS應激及炎癥反應；ZFP580還可促進內(nèi)皮祖細胞分化形成內(nèi)皮細胞，促進其體外血管形成，在內(nèi)皮細胞分化、成熟過程中發(fā)揮重要作用。那么GDF-15是否通過調(diào)控ZFP580/ZNF580表達進而降低缺血再灌注無復流損傷？
　　本實驗擬通過大鼠在體缺血再灌注無復流模型及臍靜脈

4、內(nèi)皮細胞（Humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs）體外模擬缺血再灌注模型，探究ZFP580/ZNF580在GDF-15降低缺血再灌注無復流損傷中的作用及其機制。
　　方法:
　　1、建立大鼠心臟缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion,I/R）模型，結(jié)扎大鼠心臟左前降支1h，分別再灌注0h,0.5h,1h,2h,4h，檢測不同再灌注時間點大鼠心臟無復流面積、梗死面積變化

5、；ELISA檢測動物血漿、心肌組織內(nèi)GDF-15水平；
　　2、體外建立HUVECs模擬缺血再灌注（simulatedI/R,sI/R）模型；MTT實驗檢測細胞活性，基質(zhì)膠體外血管生成實驗評價內(nèi)皮細胞功能改變；
　　3、慢病毒轉(zhuǎn)染使細胞內(nèi)ZNF580過表達或干擾表達；Real-timePCR測定GDF-15、ZNF580/ZFP580和ICAM1的mRNA表達水平；WesternBlot檢測GDF-15、ZNF580/ZFP

6、580、ERK1/2、p-ERK1/2、ICAM1的蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠心肌缺血再灌注后，心臟無復流、梗死發(fā)生率上升，且GDF-15和ZFP580的表達上調(diào)
　　大鼠心臟缺血1h，再灌注不同時間點，sham（假手術(shù)）組只穿線不結(jié)扎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除sham組，其他I/R組均有心電圖異常改變和無復流、心肌梗死發(fā)生。各I/R組缺血范圍無統(tǒng)計學差異，無復流及梗死現(xiàn)象發(fā)生。同時，實時定量RT-PCR和Western

7、Blot的結(jié)果顯示，缺血再灌注處理能在mRNA和蛋白水平刺激GDF-15和ZFP580的表達，各I/R組GDF-15、ZFP580表達水平均較sham組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ELISA結(jié)果顯示，各I/R組血漿和心肌組織內(nèi)GDF-15水平均較sham組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2、模擬缺血再灌注處理降低HUVECs活性并誘導GDF-15和ZNF580的表達
　　HUVECs于缺氧罐內(nèi)模擬缺血

8、1h，而后模擬再灌注（0h,0.5h,1h,2h,4h），Control組不做處理。MTT結(jié)果顯示：模擬缺血再灌注組細胞活性較Control組降低；RT-PCR和WesternBlot的結(jié)果顯示：GDF-15和ZNF580表達水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3、GDF-15顯著誘導ZNF580表達，并降低模擬缺血再灌注影響
　　給予HUVECs不同劑量（1,10,20,50,100ng/mL）G

9、DF-15刺激1h，結(jié)果顯示GDF-15刺激組的ZNF580表達量均較Control組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且20ng/mL升高最為明顯；再以20ng/mLGDF-15刺激不同時間（15min,30min,1h,2h,4h），結(jié)果顯示1h時ZNF580表達量最高。故后續(xù)實驗GDF-15刺激條件定為20ng/mL刺激1h。以此條件預刺激后模擬缺血再灌注，結(jié)果顯示：GDF-15能在模擬缺血再灌注的基礎(chǔ)上進一步促進ZNF58

10、0的表達，且可顯著降低模擬缺血再灌注導致的ICAM1的高表達，同時可逆轉(zhuǎn)模擬缺血再灌注導致的細胞活性降低和體外血管形成數(shù)目減少現(xiàn)象。
　　4、ZNF580在GDF-15降低模擬缺血再灌注影響中的重要作用
　　轉(zhuǎn)染慢病毒載體Lenti-ZNF580和Lent-siZNF580使HUVECs內(nèi)ZNF580過表達和干擾表達，轉(zhuǎn)染空載病毒Lenti-NC和亂序載體Lenti-si-scrambled作為對照。實時定量RT-PCR和W

11、B結(jié)果顯示：Lenti-NC和Lenti-si-scrambled組ZNF580表達量與Control組無統(tǒng)計學差異；Lenti-ZNF580組ZNF580表達顯著提高，Lent-siZNF580組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染Lenti-si-scrambled、Lent-siZNF580病毒的HUVECs經(jīng)GDF-15預刺激后模擬缺血再灌注，發(fā)現(xiàn)干擾ZNF580表達后進一步提高sI/R造成的ICAM1高表達，進一步

12、降低細胞活性和血管生成數(shù)目，而GDF-15預刺激組能一定程度消除上述影響而起到保護作用。過表達ZNF580能部分消除sI/R造成的ICAM1表達升高、細胞生存率降低和體外血管生成減少。
　　5、GDF-15通過ERK1/2通路調(diào)控ZNF580發(fā)揮降低模擬缺血再灌注后損傷作用
　　根據(jù)文獻報道和以往工作基礎(chǔ)，我們進一步研究了GDF-15通過ERK1/2信號傳導途徑調(diào)控ZNF580在模擬缺血再灌注中的具體作用。WB結(jié)果表明：細胞

13、預處理GDF-15后，p-ERK1/2表達量明顯升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），ERK1/2無明顯變化。采用ERK1/2特異性阻滯劑PD98059阻斷ERK1/2通路后，發(fā)現(xiàn)PD98059能一定程度降低GDF-15導致的ZNF580表達升高，并部分消除GDF-15降低模擬缺血再灌注損傷的作用。
　　結(jié)論：大鼠心肌缺血再灌注后，GDF-15和ZFP580的表達上調(diào)且無復流、梗死發(fā)生率升高；GDF-15可顯著減輕缺血再灌注損傷，且