鋅指基因ZFP580-ZNF580在GDF-15影響缺血再灌注后無復(fù)流中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：無復(fù)流是目前臨床PCI術(shù)后發(fā)生率較高的一種現(xiàn)象，與多種不良預(yù)后密切相關(guān)，可嚴(yán)重降低再灌注治療效果。生長(zhǎng)分化因子-15(Growthdifferentialfactor-15，GDF-15)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族中的一員，不僅在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖過程中發(fā)揮重要作用，而且與細(xì)胞的凋亡和死亡也有密切關(guān)系，參與多種病理生理過程，且與無復(fù)流現(xiàn)象密切相關(guān)，已成為國(guó)際研

2、究熱點(diǎn)。GDF-15在多種研究中被確認(rèn)為一種應(yīng)激反應(yīng)性蛋白，可通過PI3K/Akt、ERK1/2等信號(hào)途徑降低缺血再灌注損傷和炎癥反應(yīng)，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。然而GDF-15是否可降低無復(fù)流損傷以及通過哪些靶分子降低無復(fù)流目前尚不清楚。ZNF580是由本組篩選人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)得到的一種新型C2H2鋅指蛋白基因，ZFP580是本組隨后克隆的人ZNF580的鼠源性同源基因。前期研究發(fā)現(xiàn)ZFP580作為一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，由ERK1/2信號(hào)

3、通路介導(dǎo)從而減少心肌細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)心臟的作用；且ZFP580可通過TGFβ/ALK5/Smad2通路調(diào)節(jié)eNOS表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，并參與H2O2誘導(dǎo)的ROS應(yīng)激及炎癥反應(yīng)；ZFP580還可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化形成內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其體外血管形成，在內(nèi)皮細(xì)胞分化、成熟過程中發(fā)揮重要作用。那么GDF-15是否通過調(diào)控ZFP580/ZNF580表達(dá)進(jìn)而降低缺血再灌注無復(fù)流損傷？
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過大鼠在體缺血再灌注無復(fù)流模型及臍靜脈

4、內(nèi)皮細(xì)胞（Humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs）體外模擬缺血再灌注模型，探究ZFP580/ZNF580在GDF-15降低缺血再灌注無復(fù)流損傷中的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1、建立大鼠心臟缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion,I/R）模型，結(jié)扎大鼠心臟左前降支1h，分別再灌注0h,0.5h,1h,2h,4h，檢測(cè)不同再灌注時(shí)間點(diǎn)大鼠心臟無復(fù)流面積、梗死面積變化

5、；ELISA檢測(cè)動(dòng)物血漿、心肌組織內(nèi)GDF-15水平；
　　2、體外建立HUVECs模擬缺血再灌注（simulatedI/R,sI/R）模型；MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性，基質(zhì)膠體外血管生成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞功能改變；
　　3、慢病毒轉(zhuǎn)染使細(xì)胞內(nèi)ZNF580過表達(dá)或干擾表達(dá)；Real-timePCR測(cè)定GDF-15、ZNF580/ZFP580和ICAM1的mRNA表達(dá)水平；WesternBlot檢測(cè)GDF-15、ZNF580/ZFP

6、580、ERK1/2、p-ERK1/2、ICAM1的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠心肌缺血再灌注后，心臟無復(fù)流、梗死發(fā)生率上升，且GDF-15和ZFP580的表達(dá)上調(diào)
　　大鼠心臟缺血1h，再灌注不同時(shí)間點(diǎn)，sham（假手術(shù)）組只穿線不結(jié)扎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除sham組，其他I/R組均有心電圖異常改變和無復(fù)流、心肌梗死發(fā)生。各I/R組缺血范圍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，無復(fù)流及梗死現(xiàn)象發(fā)生。同時(shí)，實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western

7、Blot的結(jié)果顯示，缺血再灌注處理能在mRNA和蛋白水平刺激GDF-15和ZFP580的表達(dá)，各I/R組GDF-15、ZFP580表達(dá)水平均較sham組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ELISA結(jié)果顯示，各I/R組血漿和心肌組織內(nèi)GDF-15水平均較sham組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、模擬缺血再灌注處理降低HUVECs活性并誘導(dǎo)GDF-15和ZNF580的表達(dá)
　　HUVECs于缺氧罐內(nèi)模擬缺血

8、1h，而后模擬再灌注（0h,0.5h,1h,2h,4h），Control組不做處理。MTT結(jié)果顯示：模擬缺血再灌注組細(xì)胞活性較Control組降低；RT-PCR和WesternBlot的結(jié)果顯示：GDF-15和ZNF580表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、GDF-15顯著誘導(dǎo)ZNF580表達(dá)，并降低模擬缺血再灌注影響
　　給予HUVECs不同劑量（1,10,20,50,100ng/mL）G

9、DF-15刺激1h，結(jié)果顯示GDF-15刺激組的ZNF580表達(dá)量均較Control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且20ng/mL升高最為明顯；再以20ng/mLGDF-15刺激不同時(shí)間（15min,30min,1h,2h,4h），結(jié)果顯示1h時(shí)ZNF580表達(dá)量最高。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)GDF-15刺激條件定為20ng/mL刺激1h。以此條件預(yù)刺激后模擬缺血再灌注，結(jié)果顯示：GDF-15能在模擬缺血再灌注的基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)ZNF58

10、0的表達(dá)，且可顯著降低模擬缺血再灌注導(dǎo)致的ICAM1的高表達(dá)，同時(shí)可逆轉(zhuǎn)模擬缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞活性降低和體外血管形成數(shù)目減少現(xiàn)象。
　　4、ZNF580在GDF-15降低模擬缺血再灌注影響中的重要作用
　　轉(zhuǎn)染慢病毒載體Lenti-ZNF580和Lent-siZNF580使HUVECs內(nèi)ZNF580過表達(dá)和干擾表達(dá)，轉(zhuǎn)染空載病毒Lenti-NC和亂序載體Lenti-si-scrambled作為對(duì)照。實(shí)時(shí)定量RT-PCR和W

11、B結(jié)果顯示：Lenti-NC和Lenti-si-scrambled組ZNF580表達(dá)量與Control組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Lenti-ZNF580組ZNF580表達(dá)顯著提高，Lent-siZNF580組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染Lenti-si-scrambled、Lent-siZNF580病毒的HUVECs經(jīng)GDF-15預(yù)刺激后模擬缺血再灌注，發(fā)現(xiàn)干擾ZNF580表達(dá)后進(jìn)一步提高sI/R造成的ICAM1高表達(dá)，進(jìn)一步

12、降低細(xì)胞活性和血管生成數(shù)目，而GDF-15預(yù)刺激組能一定程度消除上述影響而起到保護(hù)作用。過表達(dá)ZNF580能部分消除sI/R造成的ICAM1表達(dá)升高、細(xì)胞生存率降低和體外血管生成減少。
　　5、GDF-15通過ERK1/2通路調(diào)控ZNF580發(fā)揮降低模擬缺血再灌注后損傷作用
　　根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和以往工作基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步研究了GDF-15通過ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控ZNF580在模擬缺血再灌注中的具體作用。WB結(jié)果表明：細(xì)胞

13、預(yù)處理GDF-15后，p-ERK1/2表達(dá)量明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ERK1/2無明顯變化。采用ERK1/2特異性阻滯劑PD98059阻斷ERK1/2通路后，發(fā)現(xiàn)PD98059能一定程度降低GDF-15導(dǎo)致的ZNF580表達(dá)升高，并部分消除GDF-15降低模擬缺血再灌注損傷的作用。
　　結(jié)論：大鼠心肌缺血再灌注后，GDF-15和ZFP580的表達(dá)上調(diào)且無復(fù)流、梗死發(fā)生率升高；GDF-15可顯著減輕缺血再灌注損傷，且