ZFP580及eNOS在小鼠心肌缺血模型中的表達及其意義.pdf

1、目的:
　　探討鋅指蛋白580(ZFP580)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在異丙腎上腺素(ISO)致小鼠心肌缺血模型中的表達情況，為闡明心肌缺血疾病的發(fā)病機制提供新的實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.將50只雄性成年昆明小鼠隨機分為5組，①對照組;②ISO，0.25mg/kg組，③ISO,1mg/kg組，④ISO,2.5mg/kg組，⑤ISO,5mg/kg組，每組10只。行ISO小鼠腹腔注射，在小鼠腹腔注射ISO后5

2、分鐘，采用BL-420生物功能實驗系統(tǒng)，對參與試驗的小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖進行記錄，當發(fā)現(xiàn)波形于ST段抬高，T波高聳，表現(xiàn)為典型心肌缺血心電圖波形，證明造模成功，繼而進行后續(xù)實驗;處死小鼠前行摘眼球放血并收集血液，對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水后同法處死。
　　2.收集小鼠血清行生化指標監(jiān)測:主要生化指標包括LDH及和CK活性數(shù)據(jù)。采用3000r/min對血清進行離心處理，并利用分光光度計對上述兩項指標進行檢測。
　　3.心肌組織

3、形態(tài)學指標檢查:對采集到的心尖部位組織進行固定、脫水、包埋處理，利用對所制組織切片進行觀察，獲取缺血心肌在形態(tài)上的變化情況。
　　4.定量RT-PCR檢測ZFP580mRNA及eNOS的表達:通過對Trizol試劑的有效利用，完成對心肌中總RNA的提取工作。取所獲取的定量總RNA(400μg)10μl體系，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈。對cDNA模板(10μl)進行簡單處理后，再與靶基因ZFP580上下游引物融合，采用PCR對50

4、μl體系進行反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照，監(jiān)測ZFP580及eNOS基因的相對表達量。
　　5.心肌組織的染色觀察:對心肌組織進行HE和免疫組織化學染色操作，并于顯微鏡下對著色情況進行觀察。對其中陽性細胞進行計數(shù)，最低計數(shù)200個心肌細胞，以陽性細胞占視野內(nèi)心肌細胞總數(shù)的百分比表示陽性率。載玻片陽性率取平均值。陰性對照:用0.01mol/L PBS代替一抗，其余步驟基本相同。
　　6.統(tǒng)計學分析:全部試驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差

5、表示，應(yīng)用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學分析（初步數(shù)據(jù)分析采用excel分析）。采用單因素方差表示組間差異，其中顯著性差異者用Student-Newmen-Kuels q檢驗，并進行兩兩比較。
　　結(jié)果:
　　1.ISO對小鼠ECG中ST段、T波及血清LDH、CK活性的影響
　　完成對小鼠的ISO腹腔注入后，小鼠表現(xiàn)為ST、T段抬升，表明小鼠出現(xiàn)典型的心肌缺血ECG改變，即模型制備成功。模型組小鼠LDH、CK活性兩項指

6、標，較對照組有明顯提升(P＞0.5)
　　2.ISO對小鼠心肌形態(tài)學的影響
　　對心肌的形態(tài)學觀察，Masson染色顯示對照組心肌細胞排列整齊，心肌免疫反應(yīng)著色為黃色。完成ISO注入后的實驗組小鼠心肌細胞排列相對紊亂，心肌多處呈現(xiàn)不規(guī)則壞死灶，并有明顯的炎癥細胞侵潤表現(xiàn)。缺血心肌染色為紅色。HE染色可見缺血心肌細胞核皺縮不規(guī)則，發(fā)生空泡樣變性。
　　3.小鼠缺血心肌細胞ZFP580mRNA及eNOS的表達
　　鋅

7、指基因ZFP580及eNOS在心肌缺血損傷中表達均降低，提示ZFP580及eNOS在心肌缺血發(fā)揮了某種調(diào)控功能，對心肌起保護作用。同時，研究結(jié)果顯示ISO可能影響心肌細胞中ZFP580的轉(zhuǎn)錄及其翻譯，其具體機制尚不完全明確。
　　4.小鼠缺血心肌細胞ZFP580蛋白及eNOS蛋白的表達
　　ZFP580定位于細胞核及細胞質(zhì)中，黃色染色細胞代表陽性反應(yīng)細胞，在實驗組小鼠心肌的ZFP580陽性細胞比例較對照組明顯偏低。eNOS蛋