人硫氧還蛋白及突變體的構(gòu)建、表達(dá)及其在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟病嚴(yán)重威脅著人類的健康。由于溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)等治療措施的廣泛應(yīng)用，使得缺血心肌能及時(shí)有效的恢復(fù)血供，可使缺血性心臟病患者的死亡率大為減少。但隨之而來的心肌缺血再灌注損傷，不僅影響血運(yùn)再通的療效，甚至可導(dǎo)致死亡。心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制復(fù)雜，心肌細(xì)胞凋亡因其可逆性而在心肌缺血再灌注損傷中具有重要的地位。
　　硫氧還蛋白（Trx）是一種廣泛分布的控制細(xì)胞還原/氧化狀態(tài)和細(xì)胞增殖/生存的小分子蛋白

2、質(zhì)，它與多種心血管疾病都有密切的關(guān)系，它除了基本的氧化還原調(diào)節(jié)功能外，還具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗細(xì)胞凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，Trx可直接與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）結(jié)合而抑制其活性；也可通過清除活性氧、與線粒體基質(zhì)中的CtyC形成復(fù)合物而抑制凋亡信號(hào)的傳遞，從而間接抑制凋亡；還可通過硝基化修飾、亞硝基化修飾這種蛋白翻譯后修飾的方式調(diào)節(jié)硫氧還蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。然而，其凋亡的抑制機(jī)制仍未完全闡明。
　　研究發(fā)現(xiàn)，Trx的氧化還

3、原調(diào)節(jié)功能是通過其活性中心位點(diǎn)Cys32-Gly-Pro-Cys35（CGPC）中的二硫鍵和巰基的互變來實(shí)現(xiàn)的。人Trx的結(jié)構(gòu)除具有CGPC活性中心外，還含有3個(gè)Cys殘基（Cys62、69、73）及1個(gè)Tyr-49殘基。它們?cè)赥rx的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮巨大作用。研究發(fā)現(xiàn)，Tyr49發(fā)生硝基化修飾后，Trx的抗凋亡作用減弱； Cys-69被亞硝基化修飾后，Trx的抗凋亡能力得到增強(qiáng)；Cys62可介導(dǎo)Cys69、73的亞硝基化修飾；Cys7

4、3亞硝基化修飾后可通過轉(zhuǎn)亞硝基作用于caspase3，抑制細(xì)胞凋亡。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Trx在高濃度的S-亞硝基化谷胱甘肽(如1 mmol／L)作用下，可能導(dǎo)致包括催化中心在內(nèi)的其他Cys的亞硝基化，甚至干擾Trx與ASK1的結(jié)合，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此推測(cè)不同的半胱氨酸殘基對(duì)亞硝基化修飾的敏感度不同，而不同位點(diǎn)的硝基化、亞硝基化狀態(tài)可能對(duì)Trx發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步闡明硝基化、亞硝基化修飾對(duì)Trx結(jié)構(gòu)和功能的影響及其調(diào)節(jié)凋亡保護(hù)心肌的

5、機(jī)制，將為Trx應(yīng)用于臨床預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷有重要的意義。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.獲得正確的pET-45b-hTrx、hTrx C32S、hTrx Y49F和hTrx C69S載體，表達(dá)出相應(yīng)具有生物學(xué)活性的蛋白。
　　2.觀察hTrx、hTrx C32S、hTrx Y49F和hTrx C69S突變體及分別給予硝基、亞硝基化修飾后對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷中心肌細(xì)胞凋亡、心肌梗死面積的影響。
　　3.獲

6、得正確的“rAd-ASK1”腺病毒包裝質(zhì)粒。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1．應(yīng)用RT-PCR方法獲得hTrx全長(zhǎng)cDNA，將DNA片段和空載體pET-45b進(jìn)行酶切連接，采用環(huán)狀定點(diǎn)誘變方法對(duì)hTrx基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得正確的pET-45b-hTrx、hTrx C32S、hTrx Y49F和hTrx C69S載體，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng) Ni-NTA柱純化、內(nèi)毒素親和柱去除內(nèi)毒素后獲得具有生物學(xué)活性的野生型和突變型hTrx蛋

7、白。
　　2．制備小鼠缺血再灌注模型，分別用PBS，hTrx，硝基、亞硝基C32S hTrx，亞硝基C69S hTrx，硝基Y49F hTrx干預(yù)，再灌注3 h，分別檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡(TUNEL染色)和Caspase-3活性。再灌注24 h后，測(cè)定心肌梗死范圍（伊文氏藍(lán)－TTC染色）。
　　3．應(yīng)用基因克隆及重組技術(shù)，將 ASK1基因的CDS區(qū)分段構(gòu)建至穿梭載體pYr-ads-1-FLAG-N上。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

8、>　　1．成功構(gòu)建了野生型hTrx，及C32S，C69S和Y49F突變體的載體質(zhì)粒，其所誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白具有活性，符合下一步實(shí)驗(yàn)需求。
　　2．建立小鼠缺血再灌注模型，分別腹腔注射不同劑量的重組hTrx，C32S，C69S和Y49F蛋白，觀察到：（1）C32S突變體降低MIRI導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和心梗范圍的作用較野生型弱；硝基化修飾后其上述作用減弱；而亞硝基化修飾后其上述作用增強(qiáng)；（2）Y49F突變體對(duì)MIRI導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和心梗范圍保

9、護(hù)作用較野生型hTrx無顯著性差異，硝基化修飾不能增加其細(xì)胞凋亡數(shù)目和心梗范圍面積；（3）C69S突變體對(duì)MIRI導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和心梗范圍保護(hù)作用較野生型hTrx無顯著性差異，但亞硝基化修飾不能增強(qiáng)其保護(hù)作用。
　　3．獲得了正確的“rAd-ASK1”腺病毒。
　　結(jié)論：
　　1．本研究構(gòu)建了野生型hTrx，及C32S，C69S和Y49F突變體的載體，經(jīng)原核表達(dá)、純化、去除內(nèi)毒素獲得相應(yīng)具有生物活性的蛋白。