肢體缺血再灌注大鼠腦組織中iNOS、nNOS、eNOS的mRNA表達及其意義.pdf

1、背景:肢體缺血再灌注損傷(LIRI)是臨床中經(jīng)常發(fā)生的病理過程，如斷肢再植術、肢體外出血使用止血帶、嚴重的擠壓傷后、大血管栓塞再通或損傷修復等，均可造成以肢體損傷為中心的多臟器損傷，甚至多器官功能障礙，使肢體缺血再灌注損傷成為臨床肢體血運重建后出現(xiàn)意外致殘、致死的主要原因之一。肢體缺血再灌注造成遠隔器官損傷的病理機制目前尚未明確，已證實中性粒細胞和氧自由基參與介導的炎癥反應和氧化應激與此有重要關系。其中氧自由基既可以造成組織細胞的脂質過

2、氧化，還可以引起一系列的炎癥反應和細胞損傷，是一種非常重要的損傷因素。一氧化氮(NO)作為生物體內重要的信使分子和效應分子，是迄今發(fā)現(xiàn)的與炎癥反應和氧化應激損傷密切相關的兩個氣體信使分子之一。體內NO的半衰期短，生物作用完全依賴一氧化氮合酶(NOS)，所以NOS是NO合成的關鍵酶。目前研究證實NOS-NO參與了肢體長時間缺血再灌注后的腦組織損傷過程，其中誘導型NOS(iNOS)有明顯時間含量改變規(guī)律。是否神經(jīng)元型NOS(nNOS)和內皮

3、型NOS(eNOS)也存在如此的變化?目前國內外并未見相關研究文獻。 目的:通過建立大鼠后肢缺血再灌注模型，觀察腦組織形態(tài)結構變化，運用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定腦組織中三種一氧化氮合酶亞型的時-量變化和通過比色法測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的時-量變化，最終支持長時間肢體缺血后再灌注血流對腦組織的不良影響，觀察不同亞型的NOS在此過程中的時-量變化特點，探討不同亞型NOS在氧化應激過程中的作用傾

4、向。 方法:實驗選用2月齡SD雄性大鼠56只，體重220.51～250.50g，平均226.90±8.44g，組間比較其差異無統(tǒng)計學意義。56只SD大鼠隨機分為正常組、實驗組： (1)正常組(N n=8)直接將大鼠用水合氯醛(5ml/kg)腹腔注射麻醉后，頭頂相應區(qū)域剪毛，絡合碘消毒，直接開顱剝離取出一側大腦半球，超低溫保存； (2)實驗組(I/R n=48)建立雙后肢缺血4小時模型后，再分為再灌注2小時、4小時

5、、6小時、8小時、16小時和24小時6組，每組8只。麻醉后取一側大腦半球，超低溫保存。實驗結束后，光鏡下觀察腦組織形態(tài)學改變，測定腦組織中iNOS、nNOS、eNOS各時間點的mRNA半定量表達和MDA含量、總SOD活性的變化，分析iNOS、nNOS、eNOS、MDA與SOD的相關性。 結果: 1、以各指標條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為iNOS、nNOS和eNOS的mRNA半定量結果。正常腦組織中有少量i

6、NOS、nNOS和eNOS表達，缺血再灌注2小時后均出現(xiàn)表達增強，其中iNOS缺血再灌注4小時表達到高峰，nNOS、eNOS在缺血再灌注6小時后表達達高峰，三型NOS缺血再灌注24小時均再次出現(xiàn)高表達。實驗結果以x±S表示，實驗組各時間點結果與正常組比較，差異有顯著性意義。 2、正常組和實驗組各時間點比較，隨缺血再灌注時間延長SOD活力顯著降低，MDA含量則顯著增高。SOD最低值出現(xiàn)在缺血再灌注4小時組，MDA最高值出現(xiàn)在缺血再

7、灌注4小時組。與正常組比較，差異有顯著性意義。 3、以腦組織總SOD活力為應變量，檢驗水準α=0.05(雙側)。腦組織總SOD活力與MDA含量(r=-0.475)，iNOS(r=-0.304)，nNOS(r=-0.415)，eNOS(r=-0.31)均呈顯著負相關。 4、光鏡下觀察IR 4h、24h組，腦組織水腫，神經(jīng)元受損最嚴重。大腦皮質部份神經(jīng)元胞體、胞核增大，胞漿及核密度下降，部分神經(jīng)元核仁消失；錐體細胞明顯變小，

8、著色加深，細胞周圍出現(xiàn)水腫裂隙。 結論: 1、肢體缺血再灌注后，腦組織損傷的發(fā)生與氧化應激有直接關系。由MDA和SOD的時-量變化規(guī)律可證實，此氧化應激損傷在I/R 4h最嚴重。 2、NOS作為NO的關鍵酶，其三種亞型合酶在缺血再灌注的不同時間點，也存在不同的含量表達變化規(guī)律。其中iNOS的高表達時間早于nNOS和eNOS，且三種亞型NOS均有兩個表達高峰，可認為肢體的缺血再灌注對腦組織的損傷以IR 4h和24h