Fibulin-5在缺血再灌注大鼠腦組織中的表達(dá)及調(diào)控.pdf

1、背景與目的:缺血性腦血管病的血管的閉塞啟動(dòng)了缺血性的病理過程，缺血以及隨后的再灌注損傷是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要因素，而內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及壞死又觸發(fā)了細(xì)胞間連接蛋白以及內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜之間連接的破壞，從而導(dǎo)致血腦屏障完整性的破壞，進(jìn)而引發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定也能夠影響神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生。因此維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定是缺血急性期治療的關(guān)鍵，F(xiàn)ibulin-5是細(xì)胞外間質(zhì)的重要組成部分，在組織的形成、重建和修復(fù)等各種生理過程

2、中都起著關(guān)鍵的作用。Fibulin-5作為一種多功能蛋白涉及到細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的聯(lián)系，其表達(dá)變化可以影響到內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、增殖和遷移。Fibulin-5在胚胎脈管系統(tǒng)及神經(jīng)嵴中有強(qiáng)烈的表達(dá)，但在成年組織中出現(xiàn)表達(dá)降低，而且在有血管重建或再生的組織中有明顯的激活與表達(dá)上調(diào)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，正常成人血管內(nèi)皮細(xì)胞中fibulin-5的表達(dá)很低，在損傷的血管以及缺血條件下的內(nèi)皮細(xì)胞中fibulin-5表達(dá)明顯升高。本實(shí)驗(yàn)擬觀察fib

3、ulin-5在缺血早期大鼠腦組織中的變化規(guī)律以及其與血腦屏障通透性的相關(guān)性，從而了解fibulin-5在腦缺血過程中所起的作用，并且觀察小腦頂核電刺激(fastigial nucleus stimulation，F(xiàn)NS)對(duì)缺血再灌注(ischemiareperfusion，IR)大鼠腦組織中fibulin-5表達(dá)的影響，為探索治療缺血性腦血管病提供新的思路。
　　方法:
　　第一部分:成年雄性SD大鼠108只，隨機(jī)分為正常組

4、、假手術(shù)組、IR模型6h、24h、48h和72h組。線栓法制備局灶性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，伊文思藍(lán)(Evan Blue，EB)檢測血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的通透性，激光共聚焦定位檢測fibulin-5在腦組織內(nèi)的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR測定fibulin-5mRNA表達(dá)規(guī)律，Western blot檢測缺血后fibulin-5蛋

5、白表達(dá)變化。
　　第二部分:成年雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、IR模型組(24h)和干預(yù)組（FNS組、FNS假刺激組和PI3K/Akt通道抑制劑LY294002組）。觀察FNS以及LY294002對(duì)缺血后腦組織fibulin-5表達(dá)的影響，以及與血腦屏障通透性的關(guān)系。線栓法制備MCAO模型，電刺激小腦頂核及側(cè)腦室PI3K/Akt通道抑制劑LY294002注射，EB測定BBB通透性，實(shí)時(shí)定量PCR測定fibulin-5 m

6、RNA表達(dá)規(guī)律，westernblot檢測fibulin-5蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　第一部分:①fibulin-5主要表達(dá)在細(xì)胞外間質(zhì)，也可在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá);②EB含量測定顯示，血腦屏障通透性從缺血再灌注6h時(shí)開始增加（8.63±1.03），再灌注24h（13.86±1.33）和48h（13.06±1.77）時(shí)達(dá)到高峰，72h時(shí)有所降低，但仍高于假手術(shù)組（10.66±1.47，P＜0.05），各缺血模型組與假手術(shù)組比

7、較或者各模型組之間相比都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05）。③缺血再灌注大鼠腦組織fibulin-5 mRNA表達(dá)從再灌注6h（1.22±0.03）開始升高，再灌注24h（1.48±0.05）達(dá)到高峰，48h（1.19±0.02）和72h（1.13±0.02）時(shí)有所降低，但仍高于假手術(shù)組（1.05±0.03，P＜0.05）。各缺血組與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而假手術(shù)組與正常組相比沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。④相關(guān)性分析

8、顯示，缺血腦組織fibulin-5的表達(dá)與血腦屏障通透性有明顯正相關(guān)（r=0.748，P＜0.01）。⑤大鼠缺血側(cè)腦組織fibulin-5蛋白表達(dá)從再灌注6h開始升高（1.26±0.46），再灌注24h（1.78±0.48）達(dá)到高峰，72h（0.89±0.27）時(shí)有所降低，但仍高于假手術(shù)組（0.30±0.14，P＜0.05）。
　　第二部分:①相對(duì)于IR模型組（13.68±1.51），F(xiàn)NS可以明顯降低缺血腦組織EB含量（9.25

9、±0.83，P＜0.01），而FNS假刺激組與模型組比較，EB含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（13.47±1.44，P＞0.05），這說明FNS可以降低BBB通透性的破壞，而LY294002干預(yù)組EB含量（16.93±0.44）明顯高于模型組（13.68±1.51，P＜0.01）;缺血模型組及各干預(yù)組與假手術(shù)組相比都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②與IR模型組比較，F(xiàn)NS組明顯上調(diào)fibulin-5 mRNA的表達(dá)（1.62±0.02，P＜0.01）

10、，F(xiàn)NS假刺激組無此效果(1.46±0.02，P＞0.05)，同時(shí)LY294002干預(yù)組（1.27±0.03）fibulin-5 mRNA的表達(dá)有明顯降低(P＜0.01);③大鼠腦組織fibulin-5蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)趨勢相似，相對(duì)于IR模型組（0.45±0.03），F(xiàn)NS組fibulin-5蛋白表達(dá)有明顯升高（0.66±0.07，P＜0.05），而且FNS假刺激組fibulin-5的表達(dá)與模型組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.43±0

11、.05，P＞0.05），LY294002干預(yù)組fibulin-5的表達(dá)明顯降低（0.28±0.03，P＜0.01）。
　　結(jié)論:缺血再灌注大鼠缺血腦組織內(nèi)fibulin-5 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，并且與血腦屏障通透性有明顯正相關(guān)性。FNS干預(yù)后缺血腦組織中fibulin-5的表達(dá)明顯上調(diào)，并且血腦屏障通透性降低，同時(shí)PI3K/Akt通道抑制劑LY294002干預(yù)后fibulin-5表達(dá)降低，伴隨血腦屏障通透性增加，說明f