缺血再灌注對(duì)小鼠腸神經(jīng)叢nNOS和iNOS表達(dá)的影響.pdf

1、腸道是缺血再灌注損傷(IRI)最敏感的組織之一，而且它是機(jī)體最大的細(xì)菌和內(nèi)毒素儲(chǔ)藏場(chǎng)所。正常情況下，具有完整生理功能的腸粘膜對(duì)腸道中的細(xì)菌和內(nèi)毒素起到屏障的作用，使其不能進(jìn)入機(jī)體內(nèi)。腸的IRI是外科實(shí)踐中常見的組織器官損傷之一，它不僅可以引起消化道局部的組織損害，而且可以導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)菌和毒素移位進(jìn)入血液循環(huán)，引起腸源性內(nèi)毒素血癥和細(xì)菌移位，進(jìn)而導(dǎo)致大量相關(guān)介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，甚至發(fā)生多臟器功能失常綜合征(MODS)。腸的IRI在腹主動(dòng)脈

2、瘤手術(shù)、小腸移植、心肺分流術(shù)、絞窄疝和新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎等疾患的演變過程中起重要作用。越來越多的研究證明，IRI的機(jī)制是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，其中包括Ca2+超載、白細(xì)胞粘附、高能磷酸化合物的缺乏、抗氧自由基的損傷和一氧化氮(NO)的作用等。其中NO在腸IRI中的作用受到廣泛的關(guān)注。對(duì)一氧化氮合酶(NOS)在腸IRI中表達(dá)的研究，有助于我們探索控制腸IRI的方法，為研究相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 NO是一種非經(jīng)典的

3、神經(jīng)遞質(zhì)，在腸的IRI中起著非常重要的作用。它是由NOS催化L-精氨酸生成。NOS的三個(gè)亞型已被純化和克隆成功，Ⅰ型為神經(jīng)元型NOS(nNOSorNOS1)，Ⅱ型為誘導(dǎo)型NOS(iNOSorNOS2)，Ⅲ型為內(nèi)皮型NOS(eNOSorNOS3)，nNOS和eNOS又常稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)。NOS是NO合成過程中的重要限速酶，體內(nèi)NO的生物作用完全依賴NOS的活性。cNOS是生理狀態(tài)的酶，為Ca2+依賴性，它的活性在翻譯后水平受細(xì)

4、胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)。iNOS是一種非Ca2+依賴性的酶。在生理狀態(tài)下，iNOS并不表達(dá)，但病理情況下，生成iNOS。nNOS主要分布于小腸壁的神經(jīng)叢及神經(jīng)纖維，在肌間神經(jīng)叢分布較多，粘膜下神經(jīng)叢中分布相對(duì)較少，但在小腸中的nNOS主要為胞漿型。eNOS主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞及粘膜固有層的組織細(xì)胞內(nèi)。iNOS主要分布在巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等免疫細(xì)胞和組織細(xì)胞中。用消化道全層鋪片技術(shù)(WMSP)研究證明，在小腸，肌間神經(jīng)叢和粘

5、膜下神經(jīng)叢中NOS陽性神經(jīng)胞體多為卵圓形，胞漿著色較深，胞核不著色。 本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法，觀察缺血再灌注后的小鼠回腸nNOS和iNOS的表達(dá)及變化，探討nNOS和iNOS在再灌注的不同時(shí)期的表達(dá)規(guī)律，有助于進(jìn)一步了解IRI的機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)選用出生后21-22天的小鼠，體重9.4-16.6g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按缺血再灌注不同時(shí)間，將36只小鼠隨機(jī)分為：缺血45min再灌注1d、3d、5d、7

6、d組(每組8只)及對(duì)照組(4只)。又將再灌注1d、3d、5d、7d組中的每一組分為實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組(每組4只)。實(shí)驗(yàn)組用0.4％的戊巴比妥鈉(10ml/kg)腹腔注射麻醉，75％醫(yī)用酒精消毒，剖開腹膜腔，分離出腸系膜上動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉分離出的腸系膜上動(dòng)脈，45min后取出動(dòng)脈夾，恢復(fù)血供，還原腸位，縫合切口，分別再灌1d、3d、5d、7d，建立腸的IRI模型。對(duì)假手術(shù)組的處理，除不夾閉腸系膜上動(dòng)脈之外，其它步驟同實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組不作任何

7、處理。實(shí)驗(yàn)前后小鼠能自由獲取食物和飲水。然后分別將36只小鼠引頸處死，剖開腹膜腔，距離回盲部1cm處取長(zhǎng)約2cm一段回腸，用4％多聚甲醛固定，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片厚度約7μm，貼于涂有多聚L-賴氨酸膠的清潔玻璃片上烤干待用。 采用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(SABC法)，分別檢測(cè)缺血45min再灌注1d、3d、5d和7d后，nNOS和iNOS在小鼠回腸中的表達(dá)。所有切片用Olympus顯微鏡進(jìn)行

8、形態(tài)學(xué)觀察，然后每組取5張切片，每張切片在40×10倍的光鏡下隨機(jī)取4個(gè)視野，圖像經(jīng)攝像儀拍攝并輸入計(jì)算機(jī)，再經(jīng)HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)分析，計(jì)算nNOS和iNOS陽性細(xì)胞分別在各組中的平均光密度。 結(jié)果提示：再灌注1d、3d、5d、7d組中的nNOS陽性細(xì)胞平均光密度明顯高于對(duì)照組和假手術(shù)組(P＜0.01)，表明小鼠回腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)nNOS活性增強(qiáng)，NO的生成增多。研究證明，NO是腸道NANC神經(jīng)的抑制

9、性神經(jīng)遞質(zhì)，大量的NO抑制NANC時(shí)，可使腸平滑肌松馳。nNOS神經(jīng)元產(chǎn)生的NO直接擴(kuò)散到平滑肌細(xì)胞內(nèi)，提高了sGC的活性，增加cGMP生成，降低游離鈣濃度或降低肌細(xì)胞對(duì)鈣的敏感性，引起平滑肌更進(jìn)一步松馳，即改變了腸動(dòng)力，導(dǎo)致更多的細(xì)菌和內(nèi)毒素移位。由此可見，在IRI后nNOS產(chǎn)生的NO是有害的。在5d組中的iNOS在肌間神經(jīng)叢有明顯的表達(dá)(P＜0.05)，其可能的原因是與內(nèi)毒素的侵入有關(guān)。7d組中的iNOS在肌間神經(jīng)叢中的表達(dá)略減弱，