人牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、牙本質(zhì)形成和礦化是牙齒發(fā)育和牙齒損傷修復(fù)過程中的重要組成部分。近年來，牙本質(zhì)非膠原蛋白(Non-collagenousproteins，NCPs)在成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化和牙本質(zhì)形成中作用的研究已成為牙齒發(fā)育生物學(xué)和牙髓生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。到目前為止，大多數(shù)的研究集中于牙本質(zhì)特異性蛋白，而關(guān)于礦化組織特異性蛋白在牙胚發(fā)育中作用的研究較少。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(Dentinmatrixprotein1，DMP1)是一種重要的礦化組織特異性蛋白，在

2、成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)、分化和牙本質(zhì)形成中的作用越來越受到關(guān)注。但是DMP1在牙本質(zhì)形成和牙髓損傷修復(fù)中的功能和調(diào)控的分子機(jī)制報(bào)道甚少。成牙本質(zhì)細(xì)胞是如何形成DMP1?在形成時(shí)受哪些因子調(diào)控?它們間存在什么樣的相互作用?其作用機(jī)制又是如何?這些問題亟待解決。 DMP1是一種主要表達(dá)于牙本質(zhì)和骨等礦化組織的基質(zhì)蛋白，是一種新的富含絲氨酸的酸性磷酸化蛋白，組成中有1/3為門冬氨酸和谷氨酸，等電點(diǎn)為3.68。在不同的物種中，DMP1的基因結(jié)

3、構(gòu)相似，具有高度同源性，并有一些高度保守區(qū)?，F(xiàn)有的研究表明：DMP1在體內(nèi)發(fā)揮多重功能，既作為礦化調(diào)節(jié)蛋白，又作為一信號(hào)分子；過表達(dá)DMP1的細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化和促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成；能夠結(jié)合鈣離子和膠原組織，在礦化過程中發(fā)揮啟動(dòng)礦化的作用。DMP1基因敲除小鼠已經(jīng)建立，并且表現(xiàn)出牙髓腔增大，前期牙本質(zhì)帶增寬，牙本質(zhì)層變窄和礦化不全等癥狀。鑒于DMP1在牙本質(zhì)礦化中的重要作用，研究其在牙本質(zhì)形成中的具體作用機(jī)制，明確DMP1基因表達(dá)的調(diào)控方

4、式，對(duì)深入了解牙胚發(fā)育和牙髓損傷修復(fù)機(jī)理具有深遠(yuǎn)的意義。 本研究采用PCR、細(xì)胞培養(yǎng)、報(bào)告基因、凝膠電泳遷移率分析(Electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)、定點(diǎn)突變等方法，從獲得與分析人DMP15'端功能性啟動(dòng)子區(qū)序列入手，應(yīng)用具有向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化潛能的人牙髓干細(xì)胞，初步探討DMP1基因的表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)，找出在成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄機(jī)制的差異，確定礦化組織特異性調(diào)控元件的基因位置和轉(zhuǎn)

5、錄因子的作用方式，以期揭示DMP1在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成中的分子調(diào)控機(jī)制，為更深入研究DMP1的具體轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究?jī)?nèi)容及主要結(jié)果如下： 第一部分人DMP1基因啟動(dòng)子的克隆、序列測(cè)定及活性分析PCR法從人類基因組總DNA中克隆出DMP1基因啟動(dòng)子-2109～+86bp長(zhǎng)約2.2kb的部分啟動(dòng)子區(qū)序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過PCR法將已獲得的人DMP1基因啟動(dòng)子獲取不同長(zhǎng)度的DMP1基因啟動(dòng)子片段，并將

6、其構(gòu)建至報(bào)告基因載體pGL3-Basic中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至人牙髓干細(xì)胞(Humandentalpulpstemcell，HDPSC)、成骨細(xì)胞(Osteoblastcell，OC)和Hela細(xì)胞中，檢測(cè)這些細(xì)胞中DMP1的表達(dá)情況，分析不同片段啟動(dòng)子在這些細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性并進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所獲得的序列正確，啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)活性片段和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)如Smads，F(xiàn)AST-1，Tcf/Lef-1，Cbfα1，同源盒基因En-1，Meis1

7、，Msx1、2，AP1、4等；DMP1主要表達(dá)于礦化性細(xì)胞胞漿中，啟動(dòng)子活性具有礦化組織細(xì)胞特異性；初步定位了在HDPSC和OC中DMP1基本啟動(dòng)子序列區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)其在HDPSC和OC中DMP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在差異。計(jì)算機(jī)分析啟動(dòng)子-505～+86bp區(qū)發(fā)現(xiàn)，在DMP1基因啟動(dòng)子上游-505～+86bp存在較多的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或潛在的結(jié)合位點(diǎn)，其中包括Smads、AP1、Cbfα1等參與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和特異性蛋白表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。

8、 第二部分人DMP1基因在人牙髓干細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控研究通過建立體外培養(yǎng)的HDPSC體外礦化誘導(dǎo)模型，運(yùn)用RT-PCR、組織染色等法檢測(cè)細(xì)胞礦化誘導(dǎo)后DMP1mRNA表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和礦化能力的變化以及對(duì)pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86兩個(gè)片段轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDPSC在礦化誘導(dǎo)液的作用下，能夠向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化，出現(xiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞表型。與對(duì)照組相比較，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)ALP活性

9、增強(qiáng)，較早的出現(xiàn)了礦化結(jié)節(jié)，說明在誘導(dǎo)液作用下礦化能力有了明顯的提高。誘導(dǎo)后的細(xì)胞出現(xiàn)了DMP1mRNA水平增高，pGL3-P-193～86和pGL3-P-505～+86活性均出現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，尤其以pGL3-P-505～+86活性增強(qiáng)更明顯。 誘導(dǎo)礦化后具有部分成牙本質(zhì)細(xì)胞樣特征的HDPSC經(jīng)10ng/L人重組TGF-β1刺激后，細(xì)胞內(nèi)DMP1mRNA的表達(dá)水平明顯下降，并存在時(shí)間依賴性。pGL3-P-193～+86和pGL3-

10、P-505～+86轉(zhuǎn)錄活性均下降，以pGL3-P-505～+86活性下降更明顯。結(jié)合DMP1基因啟動(dòng)子-505～+86bp區(qū)的具體結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果可得出，在啟動(dòng)子-505～-193bp區(qū)存在TGF-β1下游作用分子或轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通過與相應(yīng)的作用因子相結(jié)合可能參與TGF-β1下調(diào)DMP1轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程。計(jì)算機(jī)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DMP1基因啟動(dòng)子-505～+86bp區(qū)存在多個(gè)Smad結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)TGF-β1下調(diào)DMP1可能是通過

11、Smad分子來介導(dǎo)的。 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Smad3至HDPSC后的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smad3主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，隨著TGF-β1刺激不同時(shí)間后，Smad3在細(xì)胞中的表達(dá)出現(xiàn)從胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位過程，提示Smad3參與TGF-β1信號(hào)途徑，并且在轉(zhuǎn)染Smad3后的細(xì)胞中出現(xiàn)了pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86啟動(dòng)子活性降低。進(jìn)一步證實(shí)了在Smad3存在的條件下，TGF-β1下調(diào)DMP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)更明

12、顯，尤其是對(duì)pGL3-P-505～+86活性下降更顯著，明確了在DMP1基因啟動(dòng)子-505～-193bp區(qū)的確存在Smad3結(jié)合位點(diǎn)。 結(jié)合計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，針對(duì)Smad3結(jié)合區(qū)域-209～-201bp區(qū)GTCTAGTCA序列，設(shè)計(jì)了寡核苷酸探針以及其突變探針，利用EMSA對(duì)Smad3在人DMP1基因啟動(dòng)子-505～-193bp上可能的結(jié)合位點(diǎn)GTCTAGTCA序列進(jìn)行了初步定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記的DMP1野生型探針可以與核蛋白結(jié)合

13、，形成滯后條帶，在TGF-β1的作用下，條帶更加明顯；在加入競(jìng)爭(zhēng)性非標(biāo)記探針后，未見滯后條帶形成；而突變型探針在有無TGF-β1作用下，由于個(gè)別位點(diǎn)的改變不能和核蛋白結(jié)合，故均未出現(xiàn)明顯滯后條帶。Smad3抗體與核蛋白共孵育后，出現(xiàn)了更加滯后的條帶。證明了Smad3與DMP1基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)，并且明確了TGF-β1可以通過Smad3的SBE結(jié)合位點(diǎn)-209～-201bp區(qū)GTCTAGTCA序列與人DMP1基因啟動(dòng)子相互結(jié)合，從而發(fā)

14、揮其對(duì)DMP1的下調(diào)作用。 第三部分Cbfα1和AP1對(duì)人DMP1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用分析發(fā)現(xiàn)，DMP1基因啟動(dòng)子-505～+86bp區(qū)也存在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Cbfα1和AP1的作用位點(diǎn)，通過免疫組化、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)及的定點(diǎn)突變等方法對(duì)Cbfα1和AP1對(duì)DMP1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后的HDPSC中均少量表達(dá)Cbfα1、c-Jun和c-Fos，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染三者后，蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞

15、胞漿中，并且在轉(zhuǎn)染48h后表達(dá)量均達(dá)到最高值；pGL3-P-505～+86分別與PCMV-Osf2、pRSV-c-Jun和pRSV-c-Fos共轉(zhuǎn)染至HDPSC后發(fā)現(xiàn)，Cbfα1可明顯增強(qiáng)pGL3-P-505～+86啟動(dòng)子活性(P＜0.05)，而c-Jun和c-Fos能夠降低pGL3-P-505～+86啟動(dòng)子活性，以c-Jun作用更為顯著(P＜0.05)。 為進(jìn)一步驗(yàn)證它們對(duì)DMP1是否具有直接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，對(duì)Cbfα1與c-

16、Jun/c-Fos結(jié)合位點(diǎn)(分別為TTGGGAACCACAAGA，-199～-185bp和TGTCAGTCACC，-110～100bp)進(jìn)行定點(diǎn)基因突變，雙酶切和DNA測(cè)序鑒定突變效果，并將突變后的質(zhì)粒與pGL3-P-505～+86共轉(zhuǎn)染至HDPSC中，檢測(cè)蟲螢光素酶活性。結(jié)果證實(shí)，Cbfα1與c-Jun/c-Fos對(duì)DMP1轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有直接的調(diào)控作用，并且推測(cè)它們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平上可能與其它因子存在交聯(lián)作用而共同參與DMP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。