豬牙本質基質蛋白提取物的分離純化及活性檢測.pdf

1、牙齒的發(fā)育及牙胚的細胞分化是一系列口腔上皮和外胚層間充質組織細胞間相互作用的結果。牙本質形成過程中，成牙本質細胞的分化、成熟，分泌基質，以及誘導羥基磷灰石晶體沉積，都是由多種基質蛋白相互影響共同參與完成。牙本質有機基質決定其形態(tài)并且是礦物形成的基本物質。有機基質主要是膠原，非膠原基質約占10％，它在牙本質的生物礦化過程中起著模板和調節(jié)作用。目前對非膠原蛋白的研究大多集中在單一蛋白質的生物特性，但仍沒有發(fā)現牙本質形成的核心蛋白，對于非膠原

2、蛋白的混合作用研究不多。本研究采用組織蛋白提取方法從牙本質蛋白中獲得DMPCs，并利用體外實驗初步檢測混合蛋白相互作用對hDPSC生長的影響，觀察其生物活性。
　　1、牙本質基質蛋白的提取和分離純化
　　取六齡豬上下頜磨牙牙胚，4℃進行蛋白分離，磨碎后采用EDTA/鹽酸胍浸泡提取牙本質蛋白，浸泡提取7d后取上清，分別標記并加以濃縮，利用ATKA蛋白純化分析儀分離純化蛋白質，經PBS透析后濃縮以備用。經SDS-PAGE電泳圖譜

3、檢測，根據相對分子質量與相對遷移率的關系，可以計算出相對分子質量分別為:96Kda、38Kda、20Kda以及小分子，其中20Kda的染色條帶最重。與文獻中常見DSP、DPP相對分子量接近。說明EDTA提取法能夠提取到多種非膠原蛋白，同時分子量檢測證實能夠建立一條穩(wěn)定提取DMPCs的方法。
　　2、DMPCs對hDPSC生長的影響
　　設置4個實驗組：使培養(yǎng)基內DMPCs終末濃度分別為50μg/ml、100μg/mL、150

4、μg/ml、200μg/ml，并以2％FCS的DMEM培養(yǎng)液作對照組，利用MTT法、ALP法分別檢測DMPCs對hDPSC生長的影響。結果顯示，1d、3d時100μg/ml促進hDPSC增殖的能力與對照組比較有顯著差異（P<0.05），5d作用不明顯，結合hDPSC生長曲線考慮是生長飽和所致。從線性關系上分析，DMPCs對hDPSC的作用是呈遞進關系的，提示一定濃度的DMPCs可以促進牙髓干細胞增殖，在牙髓干細胞向成牙本質細胞樣細胞分化