骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)活性蛋白的提取與純化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 目的:在體外培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)，觀察其其形態(tài)特征和分類并鑒定。 方法:取幼年SD大鼠骨髓，分離培養(yǎng)BMSCs，相差顯微鏡下觀察其形態(tài)，傳代后觀察其生長特點(diǎn)，用免疫組化方法加以鑒定。 結(jié)果:原代培養(yǎng)15天左右可分離得到BMSCs，在五代以前生長形態(tài)較穩(wěn)定，典型的BMSCs形態(tài)有兩個(gè)類型。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞表達(dá)CD2

2、9、CD54，但不表達(dá)CD34、Laminin。 結(jié)論:分離培養(yǎng)的BMSCs成分單一，適用于其神經(jīng)活性物質(zhì)提純的研究。 第二部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液中神經(jīng)活性物質(zhì)的提取與純化 目的:分離純化BMSCs培養(yǎng)液中蛋白，以獲得某些神經(jīng)活性物質(zhì)。探討從BMSCs培養(yǎng)液中提取與純化神經(jīng)營養(yǎng)因子的可行性。 方法:取幼年SD大鼠骨髓，采用直接貼壁法行BMSCs培養(yǎng)、傳代，選擇P2-P5，待細(xì)胞生長融合達(dá)80

3、％時(shí)采用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)后收集其培養(yǎng)液。對(duì)培養(yǎng)液超濾濃縮并離心后采用SephadexG-100層析以獲得不同組分的蛋白。行脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的培養(yǎng)，將得到的不同蛋白成分加入神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，72h后行MTT實(shí)驗(yàn)測得有神經(jīng)活性成分的蛋白。將所得到的蛋白行高效液相色譜分析(HPLC)分析，同樣將分離的各蛋白加入神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，72h后采用MTT法測出神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，同時(shí)對(duì)不同作用組神經(jīng)元采用NSE免疫組化染色，觀察其細(xì)胞狀態(tài)和測

4、量其軸突長度進(jìn)一步證實(shí)其神經(jīng)活性作用。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)電泳(SDS-PAGE)方法對(duì)最終得到的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白進(jìn)行分析，并和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量相比來確定其分子量。 結(jié)果:BMSCs培養(yǎng)液經(jīng)超濾濃縮后行SephadexG-100層析得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)峰，MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)工工工峰有明顯的神經(jīng)活性作用；對(duì)工Ⅲ峰行HPLC分析后得到A、B、C三個(gè)峰，通過MTT法和神經(jīng)軸突長度的測量，證實(shí)A峰和B峰對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長有明顯促進(jìn)作

5、用。對(duì)A、B峰行SDS-PAGE分析，證實(shí)為單一蛋白帶，其分子量分別為18KD和14KD。 結(jié)論:BMSCs條件培養(yǎng)液中可分離出神經(jīng)活性物質(zhì)，其分子量分別為18KD和14KD。 第三部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞胞漿中神經(jīng)活性物質(zhì)的提取與純化 目的:分離純化MSCs胞漿中神經(jīng)營養(yǎng)蛋白并驗(yàn)證其神經(jīng)活性作用。以獲得某些神經(jīng)活性物質(zhì)。探討從BMSCs胞漿中直接提取與純化神經(jīng)營養(yǎng)因子的可行性。 方法:取幼年SD大鼠骨

6、髓，采用直接貼壁法行BMSCs培養(yǎng)、傳代，選擇P5，待細(xì)胞生長融合達(dá)80％時(shí)采用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)后用PBS漂洗細(xì)胞并收集，低溫下將MSCs超聲粉碎并離心。取上清液過超濾濃縮系統(tǒng)，由此獲得分子量大于10KD蛋白濃縮液6ml。對(duì)蛋白濃縮液采用SephadexG-100層析以獲得不同組分的蛋白。行脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的培養(yǎng)，將得到的不同蛋白成分加入神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，72h后行MTT實(shí)驗(yàn)測得到有神經(jīng)活性成分的蛋白。將所得到的蛋白行高效液

7、相色譜分析(HPLC)分析，同樣將分離的各蛋白加入神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，72h后采用MTT法測出神經(jīng)活性蛋白，同時(shí)對(duì)不同作用組神經(jīng)元采用NSE免疫組化染色，觀察其細(xì)胞形態(tài)和測量其軸突長度進(jìn)一步證實(shí)其神經(jīng)活性作用。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)電泳(SDS-PAGE)方法對(duì)最終得到的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白進(jìn)行分析，并和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量相比來確定其分子量。 結(jié)果:BMSCs超聲粉碎后胞漿液經(jīng)超濾濃縮后行SephadexG-100層析得到

8、Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)峰，MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ⅱ峰有明顯的神經(jīng)活性作用；對(duì)Ⅱ峰行HPLC分析后得到A、B兩個(gè)峰，通過MTT法和神經(jīng)軸突長度的測量，證實(shí)A峰對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長有明顯促進(jìn)作用。對(duì)A峰行SDS-PAGE分析，證實(shí)為單一蛋白帶，其分子量為13KD。 結(jié)論:BMSCs胞漿液中可分離出神經(jīng)活性物質(zhì)，其分子量分別為13KD。 第四部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子的實(shí)驗(yàn) 目的:研究BMSCs是否能分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(br

9、ain-derivedneurothophicfactor，BDNF)。 方法:分離培養(yǎng)小鼠BMSCs，利用第三代BMSCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)分別檢測培養(yǎng)3d、5d、7d、10d時(shí)BDNF的表達(dá)和含量。 結(jié)果:BMSCs培養(yǎng)上清液中含有BDNF蛋白，其含量在培養(yǎng)第七天時(shí)達(dá)高峰。結(jié)論BMSCs能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF，可從BMSCs培

10、養(yǎng)液中提取神經(jīng)營養(yǎng)因子。 第五部分不同劑量BMSCs胞漿提純活性蛋白對(duì)周圍神經(jīng)再生作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的:通過局部注射不同劑量的BMSCs胞漿提純活性蛋白觀察其對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的再生作用。 方法:隨機(jī)選擇SD大鼠30只，行左側(cè)坐骨神經(jīng)切斷并造成3mm缺損，用6mm硅膠管套接縫合。其中10只(甲組)硅膠管內(nèi)注射高劑量BMSCs胞漿提純活性蛋白，10只(乙組)硅膠管內(nèi)注射低劑量BMSCs胞漿提純活性蛋白，1