神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和白細(xì)胞介素-1α促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一種中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，帕金森病的病理改變主要在黑質(zhì)、紋狀體(尾核和殼核)，其最大特點(diǎn)是病變只侵犯單一類(lèi)型的神經(jīng)元多巴胺能神經(jīng)元，造成中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元選擇性地死亡、缺失，致紋狀體多巴胺不足，紋狀體和黑質(zhì)部位多巴胺含量顯著減少；多巴胺能神經(jīng)元主要分布在紋狀體、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)及黑質(zhì)等腦區(qū)，形成腦內(nèi)兩個(gè)多巴胺能環(huán)路。一個(gè)為從黑質(zhì)到紋狀體尾殼核的投

2、射；另一個(gè)為中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)；前者在錐體外系控制運(yùn)動(dòng)方面起關(guān)鍵作用，后者則是參與獎(jiǎng)賞效應(yīng)的重要作用系統(tǒng)。一些疾病如：帕金森病，精神分裂癥，Tourette綜合征，注意力缺陷多動(dòng)綜合征等都與多巴胺遞質(zhì)傳遞障礙有關(guān)。帕金森病導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂，使多巴胺信號(hào)傳送功能及控制運(yùn)動(dòng)的作用出現(xiàn)紊亂，從而引起一系列癥狀。帕金森病單一類(lèi)型的多巴胺能神經(jīng)元的病理改變，為多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的替代治療提供了病理基礎(chǔ)，目前藥物治療存在諸多缺陷，基因治療

3、雖然前途光明卻路途遙遠(yuǎn)，使得多巴胺能神經(jīng)元的替代治療變得緊迫。胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞的有限來(lái)源及倫理道德問(wèn)題給體外得到大量可應(yīng)用的非胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞及多巴胺能神經(jīng)元提出了必然要求，國(guó)內(nèi)外相關(guān)的理論和實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道為骨髓源性的多巴胺能神經(jīng)元的移植治療提供了理論基礎(chǔ)；骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)可以從自身獲得，無(wú)免疫排斥，無(wú)倫理道德問(wèn)題，來(lái)源豐富，骨髓源性多巴胺能神經(jīng)元是解決這一問(wèn)題的有效途徑，具有廣闊的發(fā)展前景。 多巴胺能神經(jīng)元是指主要

4、以酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞及多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)等其他表型標(biāo)志物為特征的神經(jīng)元。多巴胺受體也是其特征性表型標(biāo)志物之一，酪氨酸羥化酶是合成多巴胺等兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)裁的限速酶，它和多巴脫羥酶一起構(gòu)成鑒別多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)的標(biāo)志酶，用酪氨酸羥化酶及多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的抗血清檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元及纖維在大鼠腦的分布是經(jīng)常采用的方法，還可以用針對(duì)多巴胺的抗體和多巴胺受體的抗體，來(lái)檢測(cè)腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元及纖維的分布。 多巴胺受體可分為多巴胺D

5、1樣受體和多巴胺D2樣受體；其中多巴胺D1樣受體又可分為多巴胺D1受體和多巴胺D5受體兩種亞型；多巴胺D2樣受體又可分為多巴胺D2、D3和D4受體三種亞型。多巴胺受體D2(DRD2)含415個(gè)氨基酸殘基，是一種糖蛋白，分為長(zhǎng)型(D2L)和短型(D2s)兩種，D2L比D2s多29個(gè)氨基酸。DRD2主要位于蒼白球、丘腦核團(tuán)、基底節(jié)。在皮層中DRD2主要分布于海馬結(jié)構(gòu)及顳葉內(nèi)側(cè)腦區(qū)。DRD2在新皮層中分布是多相性的，在大部分腦區(qū)中，DRD2定

6、位于表淺的皮層，在枕部皮層定位較深。D2受體存在于紋狀體中等多棘神經(jīng)元，在棘突和棘頭的分布比胞體密集。D2免疫反應(yīng)終端形成的對(duì)稱(chēng)性突觸多于非對(duì)稱(chēng)性突觸。D2受體存在于黑質(zhì)致密部的核周體和樹(shù)突，和其他紋狀體投射相比，更集中于蒼白球外段。D2受體免疫陽(yáng)性反應(yīng)還可在嗅球的顆粒層和內(nèi)從層以及杏仁核見(jiàn)到其特殊的中樞分布，多巴胺D2受體與D1是兩種最經(jīng)典的亞型，是構(gòu)成紋狀體多巴胺能神經(jīng)直接和間接通路的主要受體。D2屬于7次跨膜受體超家族，與G蛋白耦

7、聯(lián)抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，D2受體的激活還可能誘導(dǎo)即早基因及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，是與帕金森病有關(guān)的最重要的多巴胺受體亞型之一。多巴胺通過(guò)DRD2mRNA表達(dá)的產(chǎn)物受體的介導(dǎo)，調(diào)節(jié)著與這些腦區(qū)相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能及精神活動(dòng)：感知、情感行為和運(yùn)動(dòng)。 細(xì)胞因子可以在體內(nèi)外誘導(dǎo)出多巴胺能神經(jīng)元。IL-1在多種因子中誘導(dǎo)中腦神經(jīng)前體細(xì)胞分化為酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元的作用最強(qiáng)，聯(lián)合應(yīng)用IL-1、IL-11、GDNF和LIF時(shí)，

8、多巴胺能神經(jīng)元不僅在數(shù)量上進(jìn)一步增加，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸出現(xiàn)較長(zhǎng)的突起結(jié)構(gòu)，形態(tài)上類(lèi)似于腦內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元，Zao應(yīng)用18種細(xì)胞因子在各種組合的條件下對(duì)大鼠胚胎的中腦細(xì)胞進(jìn)行了誘導(dǎo)研究，在受試的所有細(xì)胞因子中僅有白細(xì)胞介素-1(IL-1)α和β能夠誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性表達(dá)，bFGF除了促有絲分裂的作用之外，不具有誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的作用。 目前國(guó)內(nèi)外以胚胎研究為主，尚無(wú)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道，關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞體

9、外誘導(dǎo)表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元特有的酪氨酸羥化酶及多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究很多，但對(duì)多巴胺受體的表達(dá)卻研究很少。而遞質(zhì)與受體是神經(jīng)系統(tǒng)功能的不可分割的兩個(gè)方面.本實(shí)驗(yàn)用抗多巴胺受體D2L來(lái)檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元，為多巴胺能神經(jīng)元替代治療帕金森病開(kāi)辟新的途徑。 第一章大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞 目的 熟悉并掌握大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征；探討大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的分化規(guī)律；檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Ne

10、stin；為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法 健康雄性SD大鼠(Sprague-Dawleyrats)12只，體重180～220克，隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組(n=6)。2、對(duì)照組(n=6)。實(shí)驗(yàn)組為5％FBS+神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)照組為5％FBS，其他條件均相同；實(shí)驗(yàn)按照隨機(jī)、重復(fù)，對(duì)照三大原則進(jìn)行。之后采用離心法從骨髓中分離培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞：以成年斯普拉-道來(lái)(氏)大鼠(Sprague-Dawley：SD)雄性大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMS

11、Cs)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基和5％FBS進(jìn)行增殖培養(yǎng)、分化誘導(dǎo)；用SABC免疫細(xì)胞化學(xué)方從第6天開(kāi)始行神經(jīng)巢蛋白(nestin)檢測(cè)。用PBS替代第一抗體做空白對(duì)照。DAB顯色，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS日本)觀察、照相，存檔。 結(jié)果 SD大鼠股骨中分離出的骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種培養(yǎng)后0h大圓者為骨髓基質(zhì)細(xì)胞，5h后有兩大類(lèi)，一為呈圓盤(pán)狀的紅細(xì)胞；另一類(lèi)是數(shù)量較多胞體較大的大圓細(xì)胞，半懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)5d后，

12、為量少而大的細(xì)胞球和大圓細(xì)胞；大細(xì)胞球由許多小細(xì)胞組成，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定與周?chē)拇髨A細(xì)胞同性，表達(dá)nestin。10d后出現(xiàn)大克隆球形態(tài)，主要由大圓細(xì)胞組成，背景為雜細(xì)胞其形態(tài)各異。培養(yǎng)15d，胞體呈長(zhǎng)梭形，有兩個(gè)或多個(gè)突起，并有突起相互連接。用Nestin檢測(cè)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定出神經(jīng)干細(xì)胞。骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分化規(guī)律：細(xì)胞培養(yǎng)6d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)nestin陽(yáng)性細(xì)胞，為3.8％，培養(yǎng)第15d的細(xì)胞呈典型nestin強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率為22.3％，

13、達(dá)到高峰，隨后下降，30d時(shí)nestin陽(yáng)性細(xì)胞為5.8％。 結(jié)論 骨髓基質(zhì)細(xì)胞懸浮于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中并滴加5％胎牛血清，可以誘導(dǎo)增殖分化為神經(jīng)干細(xì)胞。6d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)nestin陽(yáng)性細(xì)胞，15d的細(xì)胞呈典型nestin強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)達(dá)到高峰，隨后下降，30d時(shí)nestin為弱陽(yáng)性，形態(tài)為神經(jīng)元樣細(xì)胞，有突起。 第二章大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化 目的 探索骨髓基質(zhì)源性神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化

14、為多巴胺能神經(jīng)元的分化條件和發(fā)生機(jī)制，比較不同血清濃度、不同IL-1α(白介素-1)及不同GDNF(膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)濃度等誘導(dǎo)條件下骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化情況；為BMSCs在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法 40只SD大鼠(Sprague-Dawley，SD)雄性大鼠，按照隨機(jī)、重復(fù)、對(duì)照原則共分為五組，每組8只。血清組：10％的胎牛血清；GDNF組：10ng/mlGDNF+10％的胎牛血清+神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。IL

15、-1α組：100pg/mlIL-1α+10％的胎牛血清+神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。GDNF+IL-1α組：10ng/mlGDNF+100pg/mlIL-1α+10％的胎牛血清+神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)照組：10％的胎牛血清+神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。以成年SD大鼠雄性大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用白介素-1α(IL-1α)、膠質(zhì)細(xì)胞系來(lái)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)等作為增殖及分化誘導(dǎo)因子，進(jìn)行增殖培養(yǎng)、分化誘導(dǎo)；用SABC免疫細(xì)胞化學(xué)方法及間

16、接免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 結(jié)果 加入GDNF、IL-1α三周測(cè)出DA受體D2檢測(cè)陽(yáng)性，GDNF組及IL-1α組的分化率均較對(duì)照組及血清組升高(P＜0.05)，GDNF+IL-1α組與GDNF組及IL-1α組比較分化率更加顯著(P＜0.05)，GDNF及IL-1α聯(lián)合誘導(dǎo)分化組間比較P＜0.01，組內(nèi)與血清組，對(duì)照組比較P＜0.05。GDNF及IL-1α聯(lián)合誘導(dǎo)分化骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)為多巴胺神經(jīng)元的分化率為12％