大鼠骨髓基質(zhì)細胞體外誘導分化為神經(jīng)元樣細胞兩種方法比較的實驗研究.pdf

1、目的：骨髓基質(zhì)細胞(MSCs)是存在于骨髓中除造血干細胞之外的另外一種干細胞，它不僅具有強大的增殖能力，在體外擴增可獲得大量子代細胞，同時具有多向分化潛能，在一定條件下不僅可分化為中胚層起源的細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等，還可分化為外胚層起源的神經(jīng)細胞，更為重要的是，它具有胚胎干細胞及神經(jīng)干細胞無法比擬的優(yōu)勢：自體MSCs易于獲得，可大量擴增，自體移植無免疫排斥反應，無倫理道德方面的限制，并且還可能避免了產(chǎn)生腫瘤的危險。MSC

2、s有望成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想的種子細胞。為了尋找更為理想的誘導MSCs分化為神經(jīng)元樣細胞的藥物及最佳誘導條件，本試驗分別利用三磷酸腺苷(ATP)與神經(jīng)妥樂平(NT)作為誘導劑，進行觀察比較，以期為臨床應用MSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎。 方法： 1.取一月齡SD大鼠，麻醉后無菌條件下，取雙側(cè)股骨和脛骨的骨髓，分離出MSCs，用貼壁法培養(yǎng)，并連續(xù)傳代、擴增，以獲取更純化的MSCs，連續(xù)觀察細胞生長情況，以了解其生

3、長特性。 2.分別取第2、5、8代細胞，消化后以1×104/ml密度種于24孔板中，每隔24h按順序檢測3個孔的細胞數(shù)，并計算3個孔細胞平均數(shù)，連續(xù)觀察10d，以時間(d)為橫坐標，以細胞數(shù)為縱坐標，分別繪制生長曲線，并分別計算出MSCs在對數(shù)生長期的群體倍增時間(PDT)和整個增殖期平均的PDT以及增殖后所得到的MSCs的理論數(shù)值。 3.分別用ATP與NT為誘導劑對MSCs進行誘導，比較不同濃度NT對MSCs的誘導作用

4、。 3.1NT的終濃度分為：0.5mu/ml、1mu/ml、1.75mu/ml、2.5mu/ml、5mu/ml，誘導后分別做巢蛋白(Nestine)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的免疫細胞化學染色，計算陽性細胞比例進行統(tǒng)計學分析，選出最佳誘導濃度。 3.2ATP的終濃度采用劉文忠報道的50ug/ml進行誘導。 3.3分別觀察ATP與NT在最佳誘導濃度時不同時間對MSCs的誘導作

5、用。誘導時間可分為：1d、3d、5d、7d、10d，誘導后進行免疫細胞化學染色進行檢測，計算出陽性細胞比例，進行統(tǒng)計學分析，找出兩藥各自的最佳誘導時間。 3.4對ATP與NT各自于最佳條件下誘導出的陽性細胞數(shù)進行統(tǒng)計學分析，比較兩者對MSCs的誘導作用。 結論： 1.MSCs在體外培養(yǎng)條件下具有強大的增殖能力，且生長特性穩(wěn)定；MSCs在一定條件下可向神經(jīng)元樣細胞分化，更進一步證明了其具有多向分化潛能。 2