人脂肪基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：1．建立人脂肪基質(zhì)細(xì)胞(Human adipose-derived stromal cells，hADSCs)的體外培養(yǎng)方法，觀察其體外增殖能力及生物學(xué)特性，對干細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)志進行檢測鑒定。2．誘導(dǎo)hADSCs向脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞定向分化，摸索向神經(jīng)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)條件，并初步探討其向神經(jīng)細(xì)胞分化的機制，為ADSCs作為神經(jīng)系統(tǒng)的移植細(xì)胞提供理論依據(jù)。 方法：1．細(xì)胞分離與培養(yǎng)：收集手術(shù)中廢棄的脂肪組織，Hank's液反復(fù)沖

2、洗血污，去除肉眼可見小血管和纖維，機械切割后以Ⅰ型膠原酶37℃振蕩消化60min，經(jīng)篩網(wǎng)過濾后1000r/min離心10分鐘，棄上清，所獲沉淀靜置于紅細(xì)胞裂解液中10min以溶解紅細(xì)胞，通過反復(fù)離心洗滌去除裂解液并獲得細(xì)胞沉淀，按2×104個/mL，的細(xì)胞濃度接種在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。24h后去除懸浮細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)基，2～3d換液一次。每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖特征，用

3、細(xì)胞記數(shù)法測定ADSCs生長曲線，計算細(xì)胞群體倍增時間。細(xì)胞生長至70％時融合時傳代，用0.25％的胰蛋白酶/EDTA消化細(xì)胞。鏡下觀察，細(xì)胞收縮變圓即用含血清的培養(yǎng)基終止消化。單個細(xì)胞懸液按2×104個/mL密度接種于培養(yǎng)瓶或孔板。對傳代細(xì)胞進行HE染色，利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子CD44和間充質(zhì)來源標(biāo)志波形蛋白。第三代hADSCs凍存，一個月后復(fù)蘇細(xì)胞，觀察復(fù)蘇后細(xì)胞的生長情況。2．細(xì)胞的誘導(dǎo)分化①向脂肪細(xì)胞分化

4、：傳代細(xì)胞在無血清、非融合狀態(tài)的初始條件下，實驗組以地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌吟、胰島素作為復(fù)合誘導(dǎo)劑，體外誘導(dǎo)人脂肪基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化；對照組不加誘導(dǎo)劑。觀察分化過程中細(xì)胞形態(tài)變化，油紅O染色鑒定，計算細(xì)胞分化率。②向神經(jīng)細(xì)胞分化：脂肪基質(zhì)細(xì)胞接種于預(yù)置玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄原有血清。實驗組細(xì)胞用含β-巰基乙醇 (β-mercaptoethano，β-BME)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)24h后，換用含

5、丁酸羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)和二甲基亞砜 (dimathyl sulfoxide，DMSO)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基正式誘導(dǎo)；對照組細(xì)胞不加任何誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)過程中實時監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。在6h、12h、24h、48h取出細(xì)胞爬片，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測神經(jīng)元特異性標(biāo)記物——神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase， NSE)。 結(jié)果：人脂肪組織中分離

6、培養(yǎng)出脂肪基質(zhì)細(xì)胞，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，具有良好的體外增殖能力，經(jīng)冷凍保存，復(fù)蘇后仍能較好生長。細(xì)胞生長曲線分析：細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)細(xì)胞的潛伏期約為24～48h，對數(shù)增生期為7d左右，接種10d后進入平臺期，倍增時間為62.38h。原代培養(yǎng)的部分細(xì)胞能自發(fā)向脂肪細(xì)胞分化，而傳代細(xì)胞始終保持梭形不能自發(fā)向脂肪細(xì)胞分化。培養(yǎng)細(xì)胞HE染色顯示，細(xì)胞呈梭形，胞質(zhì)豐富，弱嗜堿性染成淡藍(lán)色；免疫組化陽性反應(yīng)為胞質(zhì)被染為棕黃色，波形蛋白陽性率(97.1

7、±2.3)％，說明細(xì)胞來源于間充質(zhì)，無其它胚層細(xì)胞污染；間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD44陽性率為(85.4±3.22)％。向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)第7d，細(xì)胞變圓，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量小液滴，折光性強；隨著液滴增加，誘導(dǎo)8～14d，小液滴繼續(xù)增多、融合，聚集為房性液滴，且大小不等多散在，被油紅O染為紅色，證明為脂滴，提示細(xì)胞向脂肪細(xì)胞方向分化；誘導(dǎo)三周后，細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴，分化形態(tài)趨于完全。實驗組分化細(xì)胞陽性率為(78.6±2.2)％；對照組沒有或只有少量油

8、紅O陽性細(xì)胞。分化成熟的脂肪細(xì)胞很容易脫離瓶底，漂浮在培養(yǎng)液中。3.向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中：預(yù)誘導(dǎo)24h后，少量細(xì)胞寬大扁平的胞質(zhì)開始向核收縮。正式誘導(dǎo)2h后，部分細(xì)胞胞體收縮，折光性增強，伸出短小的突起；6h后，細(xì)胞形態(tài)呈神經(jīng)元樣改變，從簡單的雙極細(xì)胞到復(fù)雜的多極細(xì)胞均有出現(xiàn)，NSE陽性率為(37.01±3.12)％。12h后，神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)量增多，并可見部分細(xì)胞突起相連拉成網(wǎng)狀；此時NSE陽性率最高達(dá)到(63.71±3.5)％；

9、24h后，神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)量未明顯增加，且出現(xiàn)衰老現(xiàn)象；NSE陽性率降至(40.21±3.32)％。誘導(dǎo)48h后，幾乎所有神經(jīng)元樣細(xì)胞逐漸脫落死亡；NSE陽性率降至最低，為(15.33±2.61)％。實驗組相鄰時間點NSE陽性率比較，差異有顯著意義(P<0.05)。對照組細(xì)胞一直保持寬大扁平的狀態(tài)，有少量NSE弱陽性細(xì)胞，NSE陽性率在不同時間點均為3.8％左右，與實驗組同一時間點NSE陽性率比較，有顯著性差異(P<0.05)。