大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及二步法誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、成體脂肪基質(zhì)細(xì)胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）是一類(lèi)存在于脂肪組織中、具有多向分化潛能的干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，它具有幾乎和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）一樣具有較強(qiáng)的分化潛能，在一定誘導(dǎo)條件下，既可以向中胚層起源的成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，也可以向外胚層起源的神經(jīng)細(xì)胞分化，且至今為止尚未發(fā)現(xiàn)致瘤性。因其來(lái)源豐富且易于取材，將可彌補(bǔ)胚胎組織來(lái)源和

2、成體中樞來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）在應(yīng)用上的困難如來(lái)源不足、采集困難、免疫排斥、法律倫理限制等，顯現(xiàn)了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerve system，CNS）疾病細(xì)胞移植治療領(lǐng)域的巨大潛能。本課題以大鼠ADSCs為研究對(duì)象，主要從ADSCs的分離培養(yǎng)和向神經(jīng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法學(xué)上進(jìn)行研究，探討建立一種簡(jiǎn)便高效的由成體ADSCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得NSCs的方法，以期優(yōu)化成體ADSCs誘導(dǎo)分

3、化實(shí)驗(yàn)流程、提高定向分化比例，從而解決NSCs移植的種子細(xì)胞來(lái)源不足、體外定向分化率低等問(wèn)題，為細(xì)胞移植治療CNS疾病的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分：大鼠ADSCs的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及其生物學(xué)特性的觀察。 目的：分離、純化、體外培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠ADSCs，并觀察其生物學(xué)特性。 方法：無(wú)菌麻醉狀態(tài)下取SD大鼠的腹膜后脂肪組織，用剪刀剪碎并以Ⅰ型膠原酶消化離心，以含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培

4、養(yǎng)瓶，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代，CK2型倒置光學(xué)相差顯微鏡下追蹤觀察活細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)情況并拍照；四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色（間接法）檢測(cè)CD34、CD106、CD44、HLA-1等細(xì)胞表面標(biāo)志。 結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察，剛接種的細(xì)胞大多呈圓球狀，懸浮在培養(yǎng)基中，可見(jiàn)少數(shù)脂滴懸在最上層；ADS

5、Cs原代有多種形態(tài)，有圓球狀、長(zhǎng)梭形及成纖維樣。通過(guò)貼壁傳代法除去雜細(xì)胞，傳至第五代，細(xì)胞形態(tài)較為一致，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞排列整齊，有漩渦狀特征；在10％胎牛血清存在的條件下，傳代細(xì)胞每24h增殖1倍，并表達(dá)較強(qiáng)的CD44免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)率分別為CD340.8％，CD10613.6％，CD4499.7％，HLA-196.7％，符合ADSCs的表型特征。 結(jié)論：所采用的細(xì)胞分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便可行，所獲

6、得的ADSCs純度較高，細(xì)胞活力旺盛，自我更新能力強(qiáng)。 第二部分：大鼠ADSCs向神經(jīng)細(xì)胞的二步法誘導(dǎo)分化。 目的：探索以“ADSCs→神經(jīng)（干細(xì)胞）球（第一步）→神經(jīng)組織細(xì)胞（第二步）”的二步法誘導(dǎo)大鼠ADSCs向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的方法。 方法：取第五代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化：無(wú)血清Neurobasal培養(yǎng)基聯(lián)合應(yīng)用堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）20n

7、g/ml、表皮生長(zhǎng)因子（epithelial growth factor，EGF）20ng/ml和N2（1：100）添加劑，將細(xì)胞先誘導(dǎo)成神經(jīng)球，當(dāng)形成的神經(jīng)球達(dá)到15～20個(gè)/低倍視野時(shí)，機(jī)械法輕柔吹打神經(jīng)球使之離散，再以Neurobasal培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1：3比例進(jìn)行傳代。取第二代神經(jīng)球加入1％胎牛血清、5％馬血清、0.5μmol/L的維甲酸（retinoic acid，RA）和50ng/mL（brain-derived neu

8、rotrophic factor，BDNF），促進(jìn)其向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)巢蛋白（Nestin）、微管聯(lián)合蛋白2（MAP2）、β-神經(jīng)微管蛋白（β-tubulinⅢ）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）及半乳糖苷酶（Galactocerebroside，GalC）等標(biāo)志性蛋白的表達(dá)情況。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、拍照記錄，并進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)，掃描電鏡下觀察

9、分化細(xì)胞的表面形貌。 結(jié)果：傳代純化后的ADSCs貼壁生長(zhǎng)，呈梭形，增殖旺盛，幾乎不表達(dá)NSCs標(biāo)志性蛋白Nestin。無(wú)血清Neurobasal培養(yǎng)基誘導(dǎo)第3～4天時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始向中央聚集，形成多個(gè)克隆團(tuán)，第5～7天時(shí)，可見(jiàn)許多小的懸浮的神經(jīng)球出現(xiàn)。神經(jīng)球迅速增殖，14天的直徑可達(dá)100um。神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)在添加了血清及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物的Neurobasal培養(yǎng)基中逐漸展開(kāi)并呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)各異，生長(zhǎng)旺盛。于誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第4～5天開(kāi)

10、始，部分呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣改變。掃描電鏡下觀察ADSCs在未分化狀態(tài)下，細(xì)胞呈扁平成纖維樣，細(xì)胞表面分泌物不多；ADSCs分化為神經(jīng)元后，細(xì)胞立體感增強(qiáng)，細(xì)胞胞體變得梭長(zhǎng)，并發(fā)出突起，胞體表面分泌物增多。免疫熒光染色顯示神經(jīng)球高度表達(dá)NSCs標(biāo)志性蛋白Nestin；自神經(jīng)球誘導(dǎo)分化而來(lái)的細(xì)胞大部分呈β-tubulinⅢ（早期神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白）、MAP2（成熟神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白）陽(yáng)性表達(dá)、有少量表達(dá)GFAP（神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白）和Gal