脂肪基質(zhì)細胞誘導分化為神經(jīng)元過程中Bcl-2-Bax調(diào)控蛋白與線粒體凋亡的關(guān)系.pdf

1、目的：研究成人脂肪基質(zhì)干細胞體外誘導分化為神經(jīng)元過程中Bcl-2/Bax調(diào)控蛋白與線粒體凋亡通路的關(guān)系，從而為進一步增加獲得的ADSCs源性神經(jīng)元數(shù)量并延長其存活時間提供科學的指導方法。
　　方法：1參照葉長青等的實驗方法，將所取的成人脂肪組織體外分離、培養(yǎng)為ADSCs，倒置相差顯微鏡下每日觀察 ADSCs的形態(tài)學變化。2將傳至第2、3代的生長狀態(tài)良好的ADSCs，應用以含β-巰基乙醇為主要成分的誘導劑誘導其向神經(jīng)元分化，按照誘導

2、時間長短的不同將細胞分為未誘導組、預誘導組及誘導1h、3h、5h、8 h組，并在倒置相差顯微鏡下觀察誘導分化后的細胞形態(tài)學變化。3應用免疫細胞化學法和Western-blotting法分別檢測未誘導的ADSCs及預誘導組、誘導分化1h、3h、5h、8h組的神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neurons specific enolase，NSE），Bcl-2蛋白家族蛋白 Bcl-2、Bax，半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-9（Cysteine asp

3、artate specific protease-9，Caspase-9），細胞色素C（Cytochrome C，Cyt-c）及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Cysteine aspartate specific protease-3，Caspase-3）的表達情況。4透射電子顯微鏡下觀察誘導反應過程中細胞和線粒體超微結(jié)構(gòu)變化的特點。5應用激光共聚焦顯微鏡測定線粒體的熒光強度來反應線粒體膜電位值及其通透性。6應用流式細胞術(shù) Anne

4、xin/PI雙染法檢測未誘導的ADSCs及預誘導、誘導分化1h、3h、5 h、8 h時細胞的生存狀態(tài)。7統(tǒng)計學方法：所得實驗數(shù)據(jù)應用Exce l2003數(shù)據(jù)庫整理，所得數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（-x±s）表示，采用單因素方差分析對不同時間點間的數(shù)據(jù)進行比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：在預誘導組及誘導第1h、3h、5h、8h組均可見 NSE的陽性表達，在誘導第5h時NS

5、E的陽性表達率（83.60±3.20％）進入高峰期（P＜0.05），誘導第8h時NSE的表達與5h時無明顯差異（P＞0.05）。隨著誘導反應時間延長，Bc l-2的表達水平明顯逐漸降低，且以未誘導組最高（P＜0.05）；而 Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的表達水平則明顯逐漸升高，誘導至8h時達到高峰值（P＜0.05）。4應用Western-blotting法在未誘導組ADSCs檢測到NSE的弱陽性表達，在預誘

6、導組及誘導第1h、3h、5h、8h組均可見 NSE的陽性表達，在誘導第5h時 NSE的表達水平已經(jīng)進入高峰期（P＜0.05），誘導第8h時NSE的表達與5h時無明顯差異（P＞0.05）。隨著誘導反應時間的延長，Bc l-2的表達水平明顯逐漸降低，且未誘導組最高（P＜0.05）；而 Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的表達水平均逐漸升高，誘導至8h時達到高峰（P＜0.05）。5透射電子顯微鏡下觀察到誘導5h時的凋亡

7、細胞具有細胞核固縮、染色質(zhì)邊集和線粒體腫脹、空泡化等超微結(jié)構(gòu)變化特征。6激光共聚焦顯微鏡的檢測結(jié)果顯示，隨著誘導時間的延長，線粒體熒光強度逐漸減弱（P＜0.05）。7流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，誘導反應過程中的細胞存活率隨著誘導時間的延長逐漸下降，早期凋亡率、晚期凋亡或壞死率隨著誘導時間的延長而逐漸升高。
　　結(jié)論：在 ADSCs體外誘導分化為神經(jīng)元的過程中，反應至第5h時 ADSCs已經(jīng)分化成了典型的神經(jīng)元樣細胞，而且在誘導反應第