脂肪干細胞的分離培養(yǎng)及向神經元誘導過程中肌動蛋白的表達.pdf

1、背景與目的： 干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。根據個體發(fā)育過程中出現的先后次序不同，干細胞又可分為胚胎干細胞(embryonicstem cells，ESCs)和成體干細胞(adult stem cells，ASCs)。胚胎干細胞是一種高度未分化細胞，具有發(fā)育的全能性和巨大的醫(yī)學應用潛力，其在中樞神經系統(tǒng)疾病的細胞移植治療方面的運用已經獲得了一定的療效，但圍繞該研究的倫理道德問題也隨之出現，嚴重阻礙了其發(fā)展及應用。神經

2、干細胞屬于成體干細胞，其發(fā)現開辟了神經修復的新紀元。但是，人類神經干細胞主要來源于流產胚胎，其有限的來源及倫理學爭議也使其應用受到了很大的限制。因此，尋找新的干細胞來源，具有重要的意義。 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的多能干細胞，具有高度自我更新的能力及多向分化的潛能。適宜的體內或體外環(huán)境下，間充質干細胞具有分化為多種中胚層組織的能力，甚至還具有跨胚層分化為神經外胚層組織的

3、潛能，且其倫理問題大為減少，是細胞移植和組織工程的新型種子細胞，具有廣闊的應用前景。但是骨髓MSCs必須通過侵入的途經獲得，臍血、羊膜等組織所得到的細胞數量十份有限。所以，尋找更易獲得、含量豐富且易于培養(yǎng)的MSCs新來源，對MSCs的試驗研究和臨床應用，具有重要意義。脂肪組織來源豐富并且易于獲得，脂肪組織中干細胞含量遠高于骨髓中干細胞的含量，脂肪干細胞可以作為人干細胞庫的重要來源，是理想的組織工程種子細胞，有重要的研究和應用價值。本研究

4、通過對SD大鼠腹股溝脂肪組織中MSCs的分離、培養(yǎng)，體外誘導分化，生物學特性觀察，以探討脂肪來源的MSCs在體外培養(yǎng)、誘導的方法以及在分化為神經元細胞的過程中肌動蛋白的表達，為進一步研究和應用脂肪組織來源干細胞奠定基礎。 方法： 細胞培養(yǎng)： 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔過量麻醉處死，無菌條件下取出腹股溝處脂肪組織，用加入雙抗的PBS緩沖液(PBS緩沖液/100 U/L的青霉素/ 100 m

5、g/mL的鏈霉素)反復沖洗，而后眼科剪于安培瓶中充分剪碎脂肪組織，加入0/1﹪的Ⅰ型膠原酶于37℃振蕩箱內消化60min，加入PBS緩沖液稀釋，篩網過濾，1200 g離心10 min，去上清，加入低糖DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中加有10﹪的FBS，2mmol/L的L-谷氨酰胺)重懸細胞，并移入50ml一次性塑料培養(yǎng)瓶中，37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中孵育，72 h后換培養(yǎng)液(培養(yǎng)液為低糖DMEM/10﹪的FBS/2mmol/L的L-谷氨酰胺)，

6、去除未貼壁的懸浮細胞。隨后每2～3天換液，約1周后細胞達80﹪～90﹪融合時，0.25﹪胰蛋白酶消化，傳代。 向神經細胞誘導及免疫組化： 第5代的脂肪MSCs達80﹪～90﹪融合時，低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，吹打均勻后以微量可調移液器等量種植于細胞培養(yǎng)板中(各個細胞培養(yǎng)板內放置經L-多聚賴氨酸包被的消毒蓋玻片)。待細胞達到60-70﹪左右融合時，加入預誘導劑〔低糖 DMEM 培養(yǎng)基/10﹪FBS/ 10ug/ml堿性成

7、纖維細胞生長因子(basic FibroblastGrowth Factor，bFGF) 〕，培養(yǎng)24小時觀察細胞形態(tài)。取其中一細胞爬片進行神經巢蛋白(nestin)免疫熒光染色，其余更換為誘導劑〔低糖DMEM培養(yǎng)基/2﹪，5﹪，10﹪二甲基亞砜(DMSO)/6mmol/Lb-巰基乙醇(BME) 〕誘導，誘導3小時、5小時、7小時后分別取出細胞爬片終止生長，進行肌動蛋白(ACTIN)免疫細胞化學染色，神經元特異性烯醇化酶(NSE)和神經

8、巢蛋白(nestin)免疫熒光染色。 結果： 接種后24h內，經工型膠原酶消化從腹股溝脂肪組織中分離的體積較大的細胞多數已貼壁并開始伸展；大部分呈梭行，也有的呈圓型或多角形。72小時左右在相差顯微鏡中已可觀察到開始分裂增值的細胞，形狀呈較規(guī)則的梭型，有粗大突起伸出，核居中，有的可看到1-2個核仁。一周后，顯微鏡下可見大量的成纖維樣細胞成單層生長并且排列具有一定的方向性。細胞接種時，培養(yǎng)物中混有大量的紅細胞，隨培養(yǎng)時間的延

9、長，這些紅細胞隨換液次數的增多而被清除。約1周后細胞達80﹪～90﹪融合時以1∶3傳代，傳代后第一天，即可見細胞呈梭樣改變，第3-4天鋪滿瓶壁。傳至三代后，細胞形態(tài)均勻，呈長梭樣；培養(yǎng)五代后，細胞仍呈長梭樣，并且增生活躍。體外培養(yǎng)8-10代后，細胞的增值速度明顯減慢，細胞較前寬大，甚至不再增值。經低糖DMEM培養(yǎng)基/10﹪FBS/10ug/ml bFGF預誘導，可見相當一部分細胞成nestin免疫熒光染色陽性，提示有神經前體細胞生成。誘

10、導24h后更換為DMEM培養(yǎng)基/2﹪，5﹪，10﹪DMSO/6mmol/LBME誘導，3小時、5小時、7小時nestin陽性細胞逐漸減少，而NSE陽性的神經元樣細胞則大量增加。 誘導3小時、5小時、7小時后進行肌動蛋白(ACTIN)免疫細胞化學染色，可見脂肪MSCs定向分化為神經元的過程中，分化3h后，細胞體積較小，突起較短，陽性反應物分布于細胞核及胞質中，分化5、7h后，隨著細胞的生長，ACTIN蛋白在胞漿及突起均呈陽性表達，

11、并隨著突起的伸展而不斷延伸，且可見突起內有陽性表達物直達突起末端。證明肌動蛋白的表達對定向分化的神經元的生長和發(fā)育起著重要作用。 結論： 1．用Ⅰ型膠原酶成功地從Sprague-Dawley大鼠腹股溝處脂肪組織中分離和培養(yǎng)了MSCs，脂肪MSCs可以在含10﹪的FBS和2mmol/L的L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養(yǎng)基中進行體外增殖。 2．脂肪MSCs經bFGF預誘導后可有神經前體細胞的生成，這些細胞今后可能分化為