大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膽堿能樣神經(jīng)元的分化及其過程中Wnt3a表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及其向膽堿能樣神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化 目的：從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)并探討其生物學(xué)特性。研究體外BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的情況。 方法：采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)獲得大鼠BMSCs，根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁能力進(jìn)行純化，相差顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，傳至三代的細(xì)胞一部分進(jìn)行CD71免疫熒光技術(shù)檢測。另一部分細(xì)胞分為三組：誘導(dǎo)分化組，應(yīng)用音猬因子(Shh)、維甲

2、酸(RA)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)對BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化；自然分化組，加入1％血清自然分化；對照組，不加誘導(dǎo)因子，按前方法繼續(xù)培養(yǎng)BMSCs。誘導(dǎo)72h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化并進(jìn)行膽堿能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物--膽堿能乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)免疫熒光技術(shù)檢測。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)多樣，有大的扁平狀細(xì)胞、蜘蛛狀細(xì)胞和小的圓形細(xì)胞。經(jīng)傳代后，匯合細(xì)胞趨于一致，即小的成纖維樣細(xì)胞和少數(shù)大的扁平細(xì)胞。培養(yǎng)至三代的細(xì)胞幾乎都表達(dá)

3、CD71，陽性率高達(dá)99％。誘導(dǎo)72h后，誘導(dǎo)分化組的細(xì)胞由小梭形狀逐漸變?yōu)榘麧{回縮，有細(xì)長突起的細(xì)胞。ChAT免疫熒光檢測結(jié)果顯示：誘導(dǎo)分化組ChAT陽性率約為15.8％；與其它兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：經(jīng)體外全骨髓分離培養(yǎng)由貼壁能力純化的細(xì)胞呈均一性，幾乎都表達(dá)CD71，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。BMSCs有向膽堿能樣神經(jīng)元分化的潛能，Shh、RA和bFGF可以在體外誘導(dǎo)BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元的分化。 第二

4、部分 Wnt3a在大鼠骨髓源性膽堿能樣神經(jīng)元中的表達(dá) 目的：研究大鼠BMSCs誘導(dǎo)的膽堿能樣神經(jīng)元中Wnt3a的表達(dá)情況，探討Wnt3a，在BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元誘導(dǎo)分化過程中的可能作用。 方法：體外分離培養(yǎng)的第三代BMSCs進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分三組：膽堿能樣神經(jīng)元誘導(dǎo)分化組，自然分化組和對照組。誘導(dǎo)72h后，分別提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)分析Wnt3a在誘導(dǎo)前后細(xì)胞中的表達(dá)變