Galetin-3誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞肝樣分化過程中Wnt-β-catenin的表達特征.pdf

1、急性肝衰竭(Acute hepatic failure，AHF)是指由肝炎病毒感染、藥物中毒等各種原因?qū)е露虝r間內(nèi)肝臟細胞大面積壞死，進而使肝臟合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生障礙或失代償，出現(xiàn)以黃疸、腹水、肝性腦病等肝功能嚴重障礙而導致的臨床綜合征。近年來干細胞生物學的興起特別是骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療研究的開展給急性肝衰竭患者的治療帶來了新的希望。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derived mesenc

2、hymal stem cells，BMSCs)是骨髓中除了造血干細胞外的另一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，具有很強的可塑性，在一定刺激條件下可以跨越胚層橫向分化為多種組織細胞，包括成骨細胞、脂肪樣細胞、神經(jīng)樣細胞、心肌細胞以及肝樣細胞等。雖然BMSCs在機體骨髓中含量很低，并且細胞的數(shù)量會隨著機體年齡增加或體質(zhì)衰弱逐漸減少，但其在體外可以大量擴增，同時可以經(jīng)過特定條件誘導定向分化為肝樣細胞從而參與肝臟的組織損傷修復、細胞更新

3、、功能重建等病理生理過程，此外還具有自體供源、避免免疫排斥等優(yōu)點，在肝病治療中和肝臟組織工程領域都具有巨大應用潛能，利用其多向分化的能力治療急性肝衰竭有著非常廣闊的前景。而如何高效誘導BMSCs向肝樣細胞分化成為各國學者研究的熱點，這一問題的解決也是干細胞移植應用于臨床肝病治療的關鍵。但近年來對BMSCs向肝樣細胞定向分化潛能的研究多集中在其分化特性上，對其分化機制的研究尚處于初步階段，且在體外誘導劑方面進展甚少，干細胞移植的臨床應用遠

4、未達到預期效果。因此探究BMSCs向肝樣細胞分化的分子機制及尋找新的高效誘導分化的方法意義重大。
　　目前研究已經(jīng)證實干細胞生存的微環(huán)境直接影響與決定著其向成體干細胞的分化方向。因此越來越多的學者將微環(huán)境的研究作為各類干細胞定向分化機制研究的突破口和切入點。本課題組前期從大鼠急性肝功能衰竭的微環(huán)境這一“全景范圍”入手，利用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative andabsolute qua

5、ntitation，iTRAQ)蛋白質(zhì)組學技術成功篩選出了大鼠肝損傷組織內(nèi)微環(huán)境與正常肝組織微環(huán)境的差異蛋白，并通過蛋白組學相關軟件及生物信息學等方法從上述差異蛋白中篩選出BMSCs誘導分化過程中可能起作用的“關鍵”蛋白半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)，進一步通過誘導分化實驗證明了Gal-3能夠誘導大鼠BMSCs向肝樣細胞分化，說明了Gal-3是一個非常有潛力的強有力的促進BMSCs向肝樣細胞分化的因子。然而，該誘導

6、過程涉及的有關信號通路分子機制尚未明確，探究這一問題有助于進一步挖掘Gal-3誘導BMSCs肝樣分化的能力。
　　半乳糖凝集素-3是半乳糖凝集素家族中特殊的一員，廣泛表達于正常組織和腫瘤組織中，主要存在于胞質(zhì)中，在胞膜上及胞外基質(zhì)中也有，通過特殊的氨基端結構和帶有糖識別域的羧基端參與多種生理和病理過程，包括細胞生長和凋亡、細胞粘附、免疫反應調(diào)節(jié)、新生血管形成和腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移等。大量研究表明Gal-3在多種細胞的再生和組織修復過程中

7、發(fā)揮重要作用，特別是與肝細胞的再生關系密切，而確切的作用機制仍未見報道，結合我們前期實驗結果推測可能與干細胞的增殖分化有關。而BMSCs分化為肝樣細胞是一個極其復雜的過程，涉及多種細胞因子、胞內(nèi)外蛋白、胞外基質(zhì)等相互作用以及多個信號通路的交叉調(diào)控，目前普遍認為Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、Hh信號通路、PI3K/AKT信號通路、TGF-β信號通路等參與了BMSCs肝樣分化過程的調(diào)控，并發(fā)揮重要作用。其中的Wnt

8、/β-catenin信號通路與間充質(zhì)干細胞的增殖及分化密切相關，通過不同程度地調(diào)控WNT信號基因的表達，在一定條件下可以促使間充質(zhì)干細胞向成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、神經(jīng)細胞、肝樣細胞等分化。
　　Wnt信號途徑廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路，最常見的是Wnt/β-catenin信號通路。該通路主要由胞外的Wnt信號分子、胞膜上的受體、胞質(zhì)中的一個動態(tài)降解復合體APC-Axin-GS

9、K-3β復合物、關鍵蛋白β-catenin、下游轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef等組成。在Wnt信號缺失時，胞質(zhì)中的β-catenin主要被GSK-3β復合體磷酸化進而被泛素化降解，從而維持胞質(zhì)中β-catenin低水平狀態(tài)，通路處于關閉狀態(tài);當Wnt信號分子與胞膜上特異性結合后可形成Wnt-Frizzled復合體結構，抑制下游GSK-3β磷酸化活性，使胞質(zhì)中β-catinin積累并核內(nèi)轉(zhuǎn)移激活轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮基因表達調(diào)控等作用。當前已有研究表明，G

10、al-3與Wnt信號通路關系密切，其在結構和功能上與通路上的重要分子Axin、GSK-3β、β-catenin等極相似，甚至有學者指出Gal-3極有可能就是Wnt/β-catenin信號通路上與β-catenin功能類似的重要調(diào)控因子。因此，我們推測在Gal-3誘導大鼠BMSCs定向分化為肝樣細胞過程中，經(jīng)典Wnt通路可能也占據(jù)著至關重要的角色，對Gal-3誘導大鼠BMSCs向肝樣細胞定向分化過程中Wnt/β-catenin信號通路表達

11、特征的研究可對此假設進行驗證，由此為Gal-3和BMSCs在肝病的基礎研究及臨床應用提供實驗基礎。
　　目的:
　　探尋Gal-3誘導大鼠BMSCs向肝樣細胞定向分化過程中Wnt/β-catenin信號通路表達的相關分子影響機制，為Gal-3和干細胞移植在臨床上的應用提供基礎性研究。
　　方法:
　　1.SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞原代分離培養(yǎng)及鑒定:頸椎脫臼法處死實驗SD大鼠，收集股骨干和脛骨干中骨髓液，聯(lián)合采用密

12、度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法，分離出骨髓液中的骨髓間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng);取第4代貼壁生長的細胞制備成單細胞懸液，采用流式細胞術對細胞表面標志分子進行檢測鑒定，說明已成功獲得骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　2.Gal-3誘導大鼠BMSCs肝樣分化過程中WNT信號通路重要分子表達特征的檢測:取第4代BMSCs，用預先準備好的含有0.5μg/ml Gal-3的完全培養(yǎng)液進行誘導培養(yǎng)，每2天換液一次。實驗按照誘導不同階段分5組，分別為0d組、7d

13、組、14d組、21d組、28d組，提取各組總RNA、總蛋白質(zhì)，采用Q-PCR技術檢測Wnt1、Wnt3a、GSK-3β、β-catenin四個基因的mRNA水平表達情況，western blot檢測β-catenin蛋白的表達情況，其中0d組作為參照組。
　　3.Wnt信號通路阻滯劑和激動劑作用效果檢測:取第4代BMSCs細胞，分別加入含含有Gal-3+DKK-1、Gal-3+SB216763的完全培養(yǎng)液，體外誘導培養(yǎng)28d。分別

14、于第0d、7d、14、21d、28d在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照，然后提取總RNA、總蛋白質(zhì)，采用Q-PCR檢測AFP、ALB兩個基因的表達，其中0d時間點作為參照組。western blot檢測β-catenin、ALB兩個蛋白的表達情況。
　　結果:
　　分離出的SD大鼠BMSCs培養(yǎng)24h后，大部分細胞已經(jīng)貼壁，并呈集落狀生長，隨著培養(yǎng)時間延長，每個集落中細胞不斷分裂增殖，形態(tài)呈漩渦狀生長，外觀似成纖維樣細胞，

15、呈長梭形，有偽足，排列有明顯的方向性，各個集落逐漸融合。流式細胞術檢測細胞表面標志分子結果顯示CD29、CD44和CD90表達陽性，造血系干細胞標記分子CD34和CD45表達不明顯，符合骨髓間充質(zhì)干細胞特性。通過分別檢測Gal-3誘導大鼠BMSCs肝樣分化過程不同時段四個基因的表達，結果發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，各不同時間組的Wnt1、Wnt3a、GSK-3β和β-catenin的mRNA表達存在顯著差異(P＜0.01);同時，除了Wnt1的

16、21d組與14d組(P=0.07)、GSK-3β的7d組與0d組(P=0.616)、28d組與21d組(P=0.616)外，其余各基因mRNA的表達量都與前一時間點存在顯著差異(P＜0.05)，總得來看，Wnt1、Wnt3a、β-catenin表達呈現(xiàn)逐漸上調(diào)趨勢，而GSK-3β則呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，Western blot檢測β-catenin蛋白表達呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，與mRNA表達水平一致。在分別加入DKK-1和SB216763后，隨著誘導時

17、間的延長，β-catenin蛋白水平在兩組的表達趨勢是逐漸上調(diào)的，且同一時間點的SB216763組與DKK-1組相比差異顯著(P＜0.05)，前者較后者上調(diào)幅度大。ALB蛋白水平表達結果同β-catenin情況大體類似。檢測兩組AFP和ALB mRNA的表達，結果發(fā)現(xiàn)隨著誘導時間的延長，除了DKK-1組在14d時ALB和AFP的表達有輕微下調(diào)外，兩組在AFP和ALB mRNA水平的表達大體呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢，且在培養(yǎng)到14d后，同一時間點其

18、中SB216762組表達AFP和ALB的量遠高于DKK-1組(P＜0.05)。
　　結論:
　　采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法的結合可成功分離純化出SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，其細胞表面CD29、CD44和CD90表達陽性，不表達CD34和CD45; Gal-3誘導SD大鼠BMSCs肝樣分化與Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關，SB216763與Gal-3起協(xié)同激活通路促進分化作用，而DKK-1能一定程度拮抗通路