Rac1與骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞分化過程關(guān)系的研究.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone malTOW mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中除造血干細胞外另一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細胞。在不同的條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、內(nèi)皮細胞及神經(jīng)細胞等。另外，骨髓間充質(zhì)干細胞具有取材方便，對機體損傷小，體外培養(yǎng)增殖能力強等優(yōu)點，選用自體骨髓間充質(zhì)干細胞進行組織再生或移植，不僅沒有移植排異反應(yīng)，還避免了倫理紛爭。

2、因此骨髓間充質(zhì)干細胞被認為是最有前途的組織工程種子細胞。 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)系統(tǒng)組成細胞分化是目前研究的熱點，而BMSCs的準確誘導(dǎo)定向分化是其用于臨床治療的基礎(chǔ)，這就需要對BMSCs有關(guān)的信號調(diào)節(jié)、微環(huán)境作用進行深入研究。目前研究發(fā)現(xiàn)BMSCs向神經(jīng)樣細胞誘導(dǎo)分化大致上可分為四種途徑：細胞生長因子為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)、提高胞內(nèi)cAMP為基礎(chǔ)的方式誘導(dǎo)、抗氧化劑為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)、神經(jīng)細胞培養(yǎng)上清液為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)。． Rael是

3、小G蛋白Rho家族的成員之一，在細胞中以有活性的GTP形式與無活性的GDP形式存在，參與細胞骨架重組、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程，影響細胞的極性與形態(tài)、粘附與遷移、增殖與分化等細胞事件。研究證實，在神經(jīng)細胞發(fā)育過程中Racl、Cde42、RhoA參與了軸突與樹突的形成。 本實驗以BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中Racl蛋白及其活性形式表達變化為研究內(nèi)容，旨在探討Rael與BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程的關(guān)系。

4、方法：采用Pereoll法分離大鼠骨髓間充質(zhì)手細胞、通過傳代得到純化的BMSCs，并對細胞進行表型檢測及成骨、成脂肪分化能力鑒定。 取第5代的骨髓間充質(zhì)干細胞，分別應(yīng)用丁羥基茴香醚(BHA)、堿性成纖維生長因子(bFGF)聯(lián)合誘導(dǎo)劑和全反式維甲酸(RA)、β-巰基乙醇(β-ME)聯(lián)合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細胞。對誘導(dǎo)細胞進行形態(tài)觀察和免疫熒光染色檢測神經(jīng)細胞標志物。綜合比較兩種誘導(dǎo)方法的效果，從中選擇最適合的一種作為研究Racl與BMSCs

5、向神經(jīng)樣細胞過程關(guān)系的實驗方法。 根據(jù)BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程的特點，設(shè)立A-J十個實驗檢測點：細胞接種后24 h達到50％匯合為A點，接種后換成含bFGF的預(yù)誘導(dǎo)液培養(yǎng)24 h為B點，預(yù)誘導(dǎo)后換成含BHA的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)5 h為C點，誘導(dǎo)后用含N2的神經(jīng)細胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h為D點、維持培養(yǎng)長達48 h為E點，預(yù)誘導(dǎo)24 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基返回培養(yǎng)24 h為F點，誘導(dǎo)5 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基返回培養(yǎng)18

6、 h為G點、返回培養(yǎng)后再次預(yù)誘導(dǎo)24 h為H點、再次誘導(dǎo)5 h為I點，用神經(jīng)細胞維持培養(yǎng)基維持培養(yǎng)18 h后換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h為J點。 采用免疫熒光染色檢測相關(guān)細胞表型在實驗過程中的表達情況，免疫印跡(Western blot)結(jié)合免疫沉降(Pull-down)的方法測定各實驗檢測點Rael、Cdc42、RhoA蛋白及其活性形式的表達變化情況。 結(jié)果：免疫熒光染色檢測顯示體外培養(yǎng)的細胞表達間質(zhì)細胞表面抗

7、原CD29、CD90、CD106、CD71，而不表達造血細胞特異性抗原CD34、CD45，證明了所培養(yǎng)的細胞是BMSCs。組織化學(xué)染色顯示BMSCs成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化的細胞分別呈現(xiàn)堿性磷酸酶染色陽性和油紅O染色陽性，進一步鑒定了用于實驗的細胞是具有多向分化潛能的BMSCs。 對BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中神經(jīng)細胞標志物的免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示，BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)劑和RA、β-ME聯(lián)合誘導(dǎo)劑均能誘導(dǎo)BMSCs分化為表

8、達神經(jīng)細胞標志物nestin、β-tubulin和成熟神經(jīng)元標志物NSE的神經(jīng)樣細胞，而兩種方法分化的細胞均不表達星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP，BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)組和RA、β-ME聯(lián)合誘導(dǎo)組誘導(dǎo)的細胞表達成熟神經(jīng)元NSE的陽性率分別為80.05％@1 71.61％，兩者相比無統(tǒng)計學(xué)差異。 采用BHA、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中，誘導(dǎo)5 h后細胞的Racl蛋白表達水平與誘導(dǎo)前相比顯著降低，誘導(dǎo)后用神

9、經(jīng)細胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h、維持培養(yǎng)48 h與誘導(dǎo)前相比也顯著下降。誘導(dǎo)5 h的細胞用BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細胞返回BMSCs的形態(tài)，且Racl蛋白表達水平比誘導(dǎo)后的細胞顯著上升，對該返回BMSCs形態(tài)的細胞再次誘導(dǎo)，Racl蛋白表達水平仍然表現(xiàn)出誘導(dǎo)后比誘導(dǎo)前顯著下降的情況。然而，我們對誘導(dǎo)后的細胞用神經(jīng)細胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后再換回BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞不能返回BMSCs的形態(tài)，且Racl蛋白表達仍然維持在一個較

10、低的水平。BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中，Cdc42、RhoA的蛋白表達變化趨勢與Racl一致。蛋白活性檢測顯示Racl-GrIP活性蛋白表達在BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中上升，Cdc42-GTP活性蛋白與Racl-GTP變化一致，而RhoA-GTP則下降。免疫印跡實驗結(jié)果顯示，Racl、Cdc42、RhoA．蛋白表達水平在BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中顯著降低；Racl、Cdc42活性蛋白含量上升，而RhoA活性蛋白含量下降。