大鼠骨髓間充質干細胞制備及其向感覺神經元樣細胞轉化技術研究.pdf

1、目的:
　　對大鼠BMSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴增、鑒定及其向感覺神經元誘導條件進行優(yōu)化，建立本實驗室快速穩(wěn)定獲取大鼠BMSCs及其轉化為感覺神經元樣細胞技術流程，為BMSCs內耳移植治療感音神經性耳聾提供理論基礎和技術規(guī)范。
　　方法:
　　1、體外利用密度梯度離心法采集分離培養(yǎng)純化大鼠BMSCs，采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD44、CD90、CD106、CD34、CD45表達情況，成骨及成脂誘導液誘導所獲得細胞

2、向成骨細胞、脂肪細胞分化，以茜素紅及油紅O染色法鑒定成骨分化中鈣結節(jié)及脂肪分化中脂滴的形成。
　　2、用兩步法誘導大鼠BMSCs為感覺神經元樣細胞:第一步用添加EGF和IGF-1誘導液誘導BMSCs為內耳神經前體細胞，細胞免疫熒光驗證其表面蛋白SOX2和PAX8表達情況，第二步分別用BMP4誘導組和無BMP4誘導組繼續(xù)向感覺神經元樣細胞誘導，通過realtime-PCR比較各組間細胞內NeuroD、Neurog1、GluR4、NF

3、-M基因mRNA水平，選取最優(yōu)誘導方案。最后通過細胞形態(tài)學觀察、細胞免疫熒光檢測細胞表面蛋白Nestin、NeuN、GATA3、Calretinin、β-Ⅲ tubulin、Tau表達情況，對最優(yōu)方案誘導后的細胞進行鑒定。
　　結果:
　　1、通過規(guī)范化細胞制備技術獲取大量形態(tài)均一貼壁生長細胞。流式細胞儀結果顯示:細胞表面抗原CD44、CD90、CD106分別表達為99.9％、77.3％、99.5％;造血細胞來源的表面抗原C

4、D34和CD45分別表達為3.22％和4％。成脂誘導后油紅O染色可見脂滴，成骨誘導后茜素紅染色可見橙紅鈣結節(jié)，證實我們獲取大量高純度的BMSCs。
　　2、Realtime-PCR結果顯示BMP4、SHH-和RA聯(lián)合誘導能顯著提升大鼠BMSCs內NeuroD、Neurog1、GluR4、NF-M基因mRNA水平。誘導后細胞具有神經元特殊形態(tài)，處于生長平臺期，感覺神經元相關蛋白Nestin、NeuN、GATA3、Calretinin

5、、β-Ⅲ tubulin、Tau陽性，證實我們成功的將BMSCs誘導為感覺神經元樣細胞。
　　結論:
　　1、本實驗成功建立和優(yōu)化了BMSCs制備技術，規(guī)范了細胞采集、分離、培養(yǎng)及鑒定的流程，為獲取高質量BMSCs提供了理論和實踐參考。
　　2、本實驗成功建立了BMSCs誘導為感覺神經元樣細胞轉化技術;通過realtime-PCR技術、細胞形態(tài)學觀察、細胞免疫熒光技術證明BMP4、SHH和RA聯(lián)合誘導可獲得高質量感覺神