骨髓源及脂肪源干細胞向神經(jīng)元樣細胞方向分化的比較實驗研究.pdf

1、目前，干細胞移植已經(jīng)成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerve system，CNS）損傷特別是脊髓損傷（spinal cord injury，scD后功能恢復研究的熱點。適合進行移植的細胞有成體間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）以及嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）、雪旺氏細胞（schwan

2、n cells，SCs）等。主要機理在于，移植的細胞可以在CNS的神經(jīng)組織內(nèi)長期存活，分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、改善損傷區(qū)局部微環(huán)境，替代變性壞死的神經(jīng)細胞，從而促進受損傷神經(jīng)細胞軸突生長，其中ESCs取材困難、且涉及免疫排斥和倫理道德等問題；而MSCs來源豐富、取材方便、適合自體移植而不受倫理約束、且沒有免疫排斥反應，具有高度自我更新和多向分化能力，故被廣泛應用于再生醫(yī)學研究。 第一部分 ADSCs和BMSCs的取材與傳代培養(yǎng)。

3、 目的:建立獲取、傳代培養(yǎng)及初步鑒定大鼠ADSCs和BMSCs的技術體系，為下一步誘導分化及其比較實驗研究奠定基礎。 方法:1.ADSCs的取材、傳代采用酶消化法分離ADSCs。主要步驟：無菌麻醉條件下取SD成年大鼠的腹部脂肪組織，剪碎后用2.5%的Ⅰ型膠原酶37℃條件下消化60nun；之后1200rpm離心8min，棄去上層的脂肪和中間的液體，將底部的細胞重懸、以1200rpm離心8min后棄去上清，加入5ml含10%FBS

4、的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于底面積25c㎡的一次性培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、37℃、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每周換液2次。貼壁細胞達到90%融合時按1：3傳代。共傳5代以后進行細胞誘導。 2.BMSCs的取材、傳代采用全骨髓培養(yǎng)的方法分離BMSCs。主要步驟：無菌麻醉條件下取同一只成年SD大鼠的股骨和脛骨，用DMEM/F12培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，獲得的細胞懸液經(jīng)1000rpm離心8min后棄去上清，加入5ml含10

5、%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于底面積25c㎡的一次性培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、37℃、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d后棄去未貼壁細胞；每周換液2次。貼壁細胞達到90%融合時按1：3傳代。共傳5代以后進行細胞誘導。 3.干細胞特征檢測：以CD44為一抗對原代細胞進行免疫細胞化學檢測。以CD29、CD34、CD44、CD90為細胞表型對第5代細胞進行流式細胞儀檢測，分別確定ADSCs和BMSCs的干細胞特征。

6、 結(jié)果:原代BMSCs于2d后貼壁，7d后90%融合；傳代細胞的增殖潛伏期明顯變短，達到90%融合需要5d左右；第5代細胞均勻一致。原代ADSCs于1d后貼壁，9d90%融合；傳代細胞的潛伏期明顯變短，達到90%融合需要5d左右；倒置相差顯微鏡下可觀察到第5代細胞形態(tài)均勻一致，呈梭形，排列比第5代BMSCs稍整齊。經(jīng)CD44免疫細胞化學和以CD29、CD34、CD44、CD90為細胞表型的流式細胞儀檢測證實其具有干細胞特征。

7、討論及結(jié)論:采用酶消化法獲得的ADSCs和經(jīng)過貼壁法所獲得的BMSCs，在傳至第5代時、細胞形態(tài)一致，排列整齊；經(jīng)鑒定，傳代后的ADSCs和BMSCs仍擁有干細胞特征，適合進一步誘導分化研究。 第二部分 ADSCs和BMSCs誘導分化為神經(jīng)元樣細胞。 目的:比較傳代培養(yǎng)至第5代的ADSCs和BMSCs在分別加入“bFGF+ EGF”之后的誘導分化規(guī)律，以及兩種細胞誘導分化為神經(jīng)元樣細胞的差異。 方法:對傳代培養(yǎng)至

8、第5代的ADSCs和BMSCs，以含有0.5%胎牛血清的DMEM/F12，加入10ng/ml表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、20 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）進行誘導分化。3d后補充一次因子，7d換液，細胞90%融合后按1：2傳代。用Western blot和免疫組化法觀察誘導各個時間點（6h、12h、24h、72h、1

9、w、2w）細胞表達神經(jīng)標志物（Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP）的情況，并做統(tǒng)計學分析。觀察誘導1w后細胞在掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）下的形態(tài)學特征。 統(tǒng)計學分析照片由CCD成像系統(tǒng)獲得。陽性細胞計數(shù)方法：選取3個樣本，每個樣本隨機取10個不重疊視野（200×），選取100個細胞，計數(shù)陽性細胞個數(shù)，并做統(tǒng)計學分析。陽性率用“均數(shù)±標準差”表示；比較兩種來源細胞（ADS

10、Cs和BMSCs）同一個時期同一種染色的陽性率采用“獨立樣本的t檢驗”；兩種細胞同一種染色隨時間變化規(guī)律采用“單向方差分析”。統(tǒng)計軟件用SPSS（版本13.0）、P<0.05為有顯著性差異、有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果:誘導前，ADSCs和BMSCs中的少量細胞呈Nestin陽性染色，顯微鏡觀察亦有少量神經(jīng)元樣細胞存在；誘導后，ADSCs和BMSCs均分化出更多的神經(jīng)元樣細胞，但其中由BMSCs分化的神經(jīng)元樣細胞突起更長，誘導后72h，

11、誘導細胞相連形成網(wǎng)狀。具體變化：給予bFGF+EGF誘導6h后，兩種細胞即出現(xiàn)形態(tài)學上的改變，即誘導分化后的BMSCs（differentiated BMSCs，dBMSCs）和誘導分化后的ADSCs（differentiated ADSCs，dADSCs）開始收縮、形成胞體呈圓形的多突起細胞，表達Nestin陽性的dADSCs和dBMSCs分別迅速增至75.2±2.8和55.2±2.8。隨著誘導時間點延長、Nestin陽性的細胞在dA

12、DSCs和dBMSCs的表達均呈下降趨勢，誘導72h和1w后，dADSCs和dBMSCs均檢測不到Nestin陽性細胞；誘導后24h，dADSCs和dBMSCs表達神經(jīng)元標志物β-tubulinⅢ，其陽性率均在誘導1w時達到穩(wěn)定表達水平，并保持到2w；同時，dADSCs和dBMSCs都很少分化為表達GFAP陽性的細胞。 統(tǒng)計學結(jié)果表明，dADSCs隨時間變化的Nestin陽性表達漸少（F=1877.764，P=0.000）、β-

13、tubulinⅢ陽性表達漸增（F=882.435，P=0.000）趨勢，均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同時，dBMSCs隨時間變化的Nestin陽性表達漸少（F=2158.746，P=0.000）和β-tubulinⅢ陽性表達漸增（F=1800.764，P=0.000）趨勢亦具有顯著性差異（P<0.05）。由此提示，本研究采用的誘導方法可以成功地將ADSCs和BMSCs誘導為神經(jīng)元樣細胞。而經(jīng)過ADSCs和BMSCs在誘導后不同時間

14、點同一種染色陽性率的比較，均顯示為P<0.05，提示每種染色陽性率的變化在不同時間點都有顯著性差異、具有統(tǒng)計學意義；其中dADSCs隨誘導時間遞增而表達β-tubulinⅢ逐漸增強的能力（24h、72h、1w、2w分別為35.0±6.4、62.7±2.2、87.0±2.5、83.2±5.1）明顯大于dBMSCs（24h、72h、1w、2w分別為10.1±2.7、46.5±2.4、68.6±5.1、70.5±3.8），表明dADSCs向神

15、經(jīng)元樣細胞分化的能力、比dBMSCs更強。Western blot結(jié)果也支持上述推論。 討論及結(jié)論:本實驗結(jié)果提示，經(jīng)過特定細胞因子的誘導，ADSCs和BMSCs可以發(fā)生形態(tài)學和表型的變化，分化為神經(jīng)元樣細胞。在誘導前，Nestin和GFAP在ADSCs和BMSCs呈低水平表達，而β-tubulinⅢ隨著誘導時間的延長，在dADSCs和dBMSCs中逐漸呈顯著表達趨勢，提示在本實驗條件下，dADSCs和dBMSCs隨著誘導時間的

16、遞增而逐漸趨向于向神經(jīng)元樣細胞分化。值得一提的是，本實驗發(fā)現(xiàn)兩種來源的MSCs，雖經(jīng)bFGF和EGF誘導、卻仍極少分化為GFAP陽性的細胞，在提示ADSCs和BMSCs具有一定可塑性的同時、也提示了微環(huán)境對這兩種干細胞向神經(jīng)元樣細胞或神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞方向誘導分化的影響作用。 由ADSCs和BMSCs在相同誘導條件下出現(xiàn)顯著差異的分化結(jié)果可以推測，dADSCs分化為β-tubulinⅢ陽性細胞的能力更強，與BMSCs相比、ADSCs