脂肪基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中線(xiàn)粒體凋亡與自噬的關(guān)系.pdf

1、目的：探討在ADSCs誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中線(xiàn)粒體凋亡與自噬的關(guān)系，從而為進(jìn)一步增加獲得的ADSCs源性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量并延長(zhǎng)其存活時(shí)間具有重要的科學(xué)意義。
　　方法：1、參照葉長(zhǎng)青等的實(shí)驗(yàn)方法，將成人脂肪組織體外分離、培養(yǎng)為 ADSCs，倒置相差顯微鏡下每日觀察 ADSCs的形態(tài)學(xué)變化。2、將傳至第3代的成人 ADSCs，應(yīng)用以含 IBMX為主要成分的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，按照誘導(dǎo)時(shí)間的不同分為誘導(dǎo)48h、7d、

2、14d、21d組，并在倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。3、應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western-blotting分別檢測(cè)未誘導(dǎo)的ADSCs及誘導(dǎo)分化48h、7d、14d、21d的星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein, GFAP），Bcl-2蛋白家族蛋白Bcl-2、Bax及細(xì)胞色素C（Cytochrome C）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Cystein

3、e aspartate specific protease-3）及微管相關(guān)蛋白輕鏈3（Microtubule-associated protein light chain3, LC3）的表達(dá)。4、流式細(xì)胞術(shù) Annexin/PI雙染法檢測(cè)未誘導(dǎo)的ADSCs及誘導(dǎo)后48h、7d、14d、21d時(shí)細(xì)胞的生存狀態(tài)。5、透射電子顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后14d的星形膠質(zhì)細(xì)胞線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)、凋亡及自噬現(xiàn)象。6、MTT法檢測(cè) ADSCs誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)

4、胞過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用 Excel2003數(shù)據(jù)庫(kù)整理，采用統(tǒng)計(jì)軟件包 SPSS17.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以（(x)±s）表示，不同時(shí)間點(diǎn)間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、提取的原代 ADSCs于24h時(shí)已貼壁，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈三角形、短梭形。培養(yǎng)至7~10d時(shí)可見(jiàn)大量呈漩渦狀排列的長(zhǎng)梭形細(xì)胞。2、誘導(dǎo)反應(yīng)48h時(shí)，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，部分細(xì)胞的胞體周

5、圍伸出細(xì)長(zhǎng)突起，并有多個(gè)分支。誘導(dǎo)反應(yīng)7d時(shí)，細(xì)胞胞體折光性顯著增強(qiáng)，部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，并交織成網(wǎng)狀。誘導(dǎo)14d時(shí)，細(xì)胞胞體折光性較7d時(shí)更加增強(qiáng)，但細(xì)胞形態(tài)與7d時(shí)無(wú)明顯變化。誘導(dǎo)21d時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞的突起較誘導(dǎo)14d時(shí)變短、變少。3、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示GFAP在未誘導(dǎo)的ADSCs中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，而在誘導(dǎo)后各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，且在細(xì)胞體和突起部位的細(xì)胞質(zhì)均呈陽(yáng)性表達(dá)，GFAP的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率僅7d與1

6、4d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），至誘導(dǎo)7d時(shí)GFAP的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到高峰（P＜0.05）。Bax、Bcl-2、Cyt-c、Caspase-3和LC3在未誘導(dǎo)的ADSCs和誘導(dǎo)反應(yīng)的各時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，而且陽(yáng)性表達(dá)部位主要位于細(xì)胞核周?chē)募?xì)胞漿，而突起部位沒(méi)有見(jiàn)到明顯的陽(yáng)性表達(dá)。Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低（P＜0.05），在未誘導(dǎo)的ADSCs和誘導(dǎo)后各時(shí)間點(diǎn)僅7d與14d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Bax、C

7、yt-c、Caspase-3、LC3的陽(yáng)性表達(dá)率在未誘導(dǎo)的ADSCs和誘導(dǎo)后48h、7d、14d、21d之間均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.01），至誘導(dǎo)14d時(shí) Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的陽(yáng)性表達(dá)率均達(dá)到高峰（P均＜0.05）。4、Western-blotting結(jié)果顯示，GFAP在未誘導(dǎo)組的ADSCs中無(wú)表達(dá)，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量增加，至7d時(shí)達(dá)到高峰（P＜0.05）。Bcl-2的表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐

8、漸降低（P＜0.05）。LC3Ⅰ的表達(dá)隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸降低（P＜0.05）。Bax、Cyt-c、Caspase-3及LC3Ⅱ的表達(dá)水平均逐漸增加，至誘導(dǎo)14d達(dá)到高峰（P均＜0.05）。5、透射電子顯微鏡下可見(jiàn)到線(xiàn)粒體的超微結(jié)構(gòu)，凋亡小體結(jié)構(gòu)及自噬現(xiàn)象。6、流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)反應(yīng)過(guò)程中的細(xì)胞存活率隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，早期凋亡率、晚期凋亡或壞死率隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。7、MTT的結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)

9、，細(xì)胞的存活數(shù)量逐漸下降。
　　結(jié)論：1、ADSCs在應(yīng)用以IBMX為主要成分的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的第7~14d時(shí)處于最佳的存活和分化狀態(tài)，此時(shí)可以終止反應(yīng)，并對(duì)于所得的細(xì)胞進(jìn)行篩選分離和保存，以便于進(jìn)行相關(guān)的應(yīng)用和研究。2、在正常 ADSCs中，經(jīng)線(xiàn)粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生的凋亡和自噬反應(yīng)較弱。3、在ADSCs誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程中，線(xiàn)粒體凋亡和細(xì)胞自噬反應(yīng)明顯增強(qiáng)，但自噬反應(yīng)不足以清除全部受損的線(xiàn)粒體，從而引發(fā)線(xiàn)