熊果酸誘導TC-1癌細胞自噬性死亡中線粒體相關機制的探討.pdf

1、研究背景：
　　線粒體是一種普遍存在于大多數(shù)真核細胞的動態(tài)細胞器，其形態(tài)、大小、數(shù)量和分布隨著代謝條件的不同發(fā)生變化，具有多形性、運動性、易變性、和適應性等特點，其主要作用是通過氧化磷酸化產生直接能源物質三磷酸腺苷（ATP），享有“能量工廠”的美稱。大多數(shù)惡性腫瘤細胞在線粒體氧化磷酸化途徑供給ATP不足的情況下，往往更多依賴糖酵解提供能量來滿足其快速生長的需要。但是與線粒體有氧代謝相比，糖酵解代謝是非常低效率的產能過程。氧化磷酸化

2、過程發(fā)生在線粒體內膜的電子傳遞鏈上，電子傳遞鏈由一系列能可逆的接收和釋放電子或氫質子的脂蛋白復合物組成，主要由四個大型跨膜蛋白復合體組成，分別是線粒體呼吸鏈復合物 I、II、III和IV。線粒體也可以通過電子傳遞鏈產生副產物活性氧（ROS），腫瘤細胞內的ROS水平往往比正常細胞高。另外，線粒體還涉及腫瘤細胞的凋亡與自噬過程。
　　自噬是一種程序性死亡機制，根據細胞物質運到溶酶體內的途徑不同，可分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬

3、三種。一般情況下自噬所說的是大自噬，指細胞內長壽蛋白質和損傷的細胞器被雙層膜包裹，并運送到溶酶體降解和再利用的過程。自噬廣泛存在于機體病理生理過程中，如癌癥、神經退行性疾病、心血管及肺部等疾病都和自噬有密切聯(lián)系。近年大量研究表明線粒體功能與細胞自噬有關聯(lián)，已被證實線粒體功能與自噬體的形成和成熟相關，當線粒體功能障礙時，自噬體參與損傷線粒體的降解，維持細胞內線粒體的質量，從而促進細胞存活。
　　熊果酸（Ursolic acid，UA

4、）廣泛存在于天然植物和中草藥中。具有許多重要的生物效應，如抗腫瘤，抗炎，保肝和降血脂等，而且低毒。我們課題組最近發(fā)現(xiàn)熊果酸可通過誘導腫瘤細胞產生自噬相關性死亡，從而發(fā)現(xiàn)熊果酸抗腫瘤的新機制。但是在熊果酸誘導腫瘤細胞自噬相關性死亡中，線粒體的作用還不清楚。實驗目的本實驗旨在探討線粒體在熊果酸誘導 TC-1癌細胞自噬相關性死亡中的作用。
　　方法：
　　利用細胞培養(yǎng)技術，熊果酸實驗濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM，

5、作用TC-1細胞24小時后，普通光鏡下觀察細胞數(shù)目及形態(tài)的變化；各種濃度熊果酸分別作用1、2、3、4、5天后，采用MTT法檢測熊果酸對TC-1癌細胞增殖抑制作用；利用流式細胞術檢測線粒體膜跨電位及細胞內ATP和ROS水平變化；分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復合物I、II、III和IV的活性；熊果酸30μM作用TC-1細胞6小時后，在透射電鏡下檢測線粒體形態(tài)變化；熒光顯微鏡下觀察線粒體與自噬標志蛋白LC3的位置關系。
　　結果：

6、　　光鏡下可見熊果酸作用24小時，10μM濃度組的細胞形態(tài)沒有明顯改變，而20μM或30μM組的細胞變圓，貼壁松散，分布稀疏，及細胞兩極出現(xiàn)黑色小點，出現(xiàn)不同程度的細胞死亡；MTT實驗結果顯示熊果酸對TC-1癌細胞有顯著的增值抑制作用，并呈時間、劑量依賴，尤其是作用3天后，各組抑制率均達90％以上（P＜0．05)；當熊果酸作用24小時，陰性象限熒光占總熒光的比例分別為3.1%、3.8%、6.4%、24.7%，陰性象限比例越大線粒體膜跨電

7、位(Δψm)越低，表明Δψm隨著熊果酸作用濃度升高而降低，UA30μM組Δψm降低尤其顯著（P＜0．05)；線粒體呼吸鏈復合物I、II、III和IV的活性經熊果酸作用24小時均出現(xiàn)明顯抑制，尤其是復合酶IV（P＜0．05)；經熊果酸作用24小時，10μM組即出現(xiàn)細胞內ATP水平顯著降低；熊果酸30μM分別作用0、4、8、12、24小時，細胞內ATP水平隨作用時間延長逐漸降低，呈時間依賴，并且作用4小時，與對照比ATP水平降低超過50%，

8、12小時后，ATP水平接近0 nmol/mg/protein（P＜0．05)；細胞內ROS的水平也隨熊果酸作用濃度升高而顯著降低，熊果酸作用24小時細胞內ROS陽性率分別是86.46%、82.52%、69.35%、57.24%（P＜0．05)。另外，利用電鏡與熒光顯微鏡檢測線粒體自噬是否存在時，透射電鏡下發(fā)現(xiàn)熊果酸30μM作用6小時，出現(xiàn)線粒體腫脹、嵴斷裂及線粒體碎屑，并在胞漿中散在分布大量的雙層膜結構且包裹損傷的細胞器，在損傷的線粒體