腫瘤抑制基因XAF1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 自噬性死亡被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，新近研究發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤抑制中具有重要作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1(XIAP相關(guān)因子1，XAF1)可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的死亡。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用凋亡抑制劑可抑制XAF1誘導(dǎo)的凋亡，但是并不能完全抑制細(xì)胞死亡，表明XAF1基因除誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡外，還存在著其他促進(jìn)細(xì)胞死亡的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究腫瘤抑制基因XAF1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡的

2、作用及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.制備重組腺病毒Adeno-XAF1和對(duì)照病毒Adeno-Null，感染人胃癌細(xì)胞MKN45和AGS，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)XAF1基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2.應(yīng)用以下多種方法檢測(cè)XAF1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的自噬作用：(1)Western blot檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)，其中LC3Ⅱ的表達(dá)與自噬體膜的形成

3、密切相關(guān)；(2)電鏡觀察自噬體的超微結(jié)構(gòu)；(3)熒光顯微鏡觀察GFP-LC3融合蛋白的定位；(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AVOs。Western blot檢測(cè)Beclin1、phospho-Akt和phospho-p70S6k蛋白的表達(dá)探討XAF1誘導(dǎo)自噬的機(jī)制。
　　 3.應(yīng)用Beclin1 siRNA、自噬抑制劑3-MA抑制自噬作用及凋亡抑制劑Z-VAD-FMK抑制凋亡作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡或自噬作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析XAF1誘導(dǎo)的自噬

4、與凋亡的相互關(guān)系。
　　 4.建立裸鼠胃癌移植瘤模型，Western blot及免疫組化檢測(cè)XAF1、LC3和Beclin1蛋白的表達(dá)，研究XAF1基因在體內(nèi)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功制備重組腺病毒Adeno-XAF1和對(duì)照病毒Adeno-Null，胃癌細(xì)胞MKN45和AGS感染Adcno-XAF1病毒后，XA目的mRNA水平和蛋白表達(dá)與PBS組及陰性病毒對(duì)照組相比，均明顯升高。

5、
　　 2.Adeno-XAF1可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的自噬性死亡，其主要機(jī)制是上調(diào)Beclin1的表達(dá)及抑制Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路。
　　 3.下調(diào)Beclin1或應(yīng)用3-MA抑制自噬可促進(jìn)XAF1基因誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，抑制凋亡促進(jìn)XAF1基因誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的自噬性死亡。
　　 4.XAF1基因可誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞的自噬性死亡，抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：
　　 XAF1基因可誘導(dǎo)