下調(diào)MTDH基因抑制表柔比星誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌細(xì)胞自噬現(xiàn)象的研究.pdf

1、研究背景與目的:乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的首要惡性疾病。隨著乳腺癌治療的進(jìn)步，其預(yù)后在近年來取得了較大的改善，化學(xué)治療改變了傳統(tǒng)乳腺癌治療模式，使得患者的長期生存已成為現(xiàn)實。表柔比星(Epirubicin，EPI)屬于蒽環(huán)類化療藥物，是對乳腺癌治療最有效的化療藥物之一。應(yīng)用EPI過程中出現(xiàn)的獲得性耐藥亦成為降低乳腺癌治療療效的主要限制性因素。自噬(Autophagy)是一種進(jìn)化保守的代謝途徑，使真核細(xì)胞能夠降解并回收細(xì)胞組分進(jìn)行再利用。

2、對于腫瘤細(xì)胞自噬存在雙向效應(yīng)。最近研究表明，部分化療藥物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)自噬，化療誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞株的存活，自噬作用可能參與了化療耐藥性的發(fā)展。轉(zhuǎn)移黏附蛋白(Metadherin，MTDH)為多種惡性腫瘤的致癌基因，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及化療耐藥等多種惡性生物學(xué)行為的生成。同時MTDH基因亦可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬，而關(guān)于MTDH基因、自噬以及化療之間的關(guān)系鮮有報道。本研究通過檢測EPI作用于乳腺癌MDA-MB-

3、231細(xì)胞的增殖抑制作用及自噬水平的變化，檢測EPI作用于MTDH基因下調(diào)后的MDA-MB-231細(xì)胞自噬水平的變化及凋亡的變化，初步探討MTDH在乳腺腫瘤細(xì)胞自噬發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制。
　　方法:1、應(yīng)用MTT法檢測EPI對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用;
　　2、構(gòu)建針對MTDH基因的干擾表達(dá)載體MTDH-shRNA和陰性對照干擾表達(dá)載體Control-shRNA，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染MDA-MB-23

4、1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后觀察轉(zhuǎn)染效率;
　　3、免疫熒光雙染法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3分布及表達(dá)量的變化;
　　4、免疫印跡法檢測MTDH、LC3等相關(guān)分子的表達(dá)變化;
　　5、流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:1、EPI對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，且這種抑制作用存在濃度依賴性。
　　2、熒光顯微鏡觀察顯示:轉(zhuǎn)染48h后，Control-shRNA與MTDH-shRNA組轉(zhuǎn)染效率約

5、為50％。免疫印跡結(jié)果顯示:與空白對照組及Control-shRNA組相比，MTDH-shRNA組中MTDH基因在蛋白水平上表達(dá)減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而空白對照組與Control-shRNA組相比，MTDH基因在蛋白水平上表達(dá)未見明顯差異。MTDH-shRNA可以明顯下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中MTDH基因的表達(dá)。
　　3、EPI處理MDA-MB-231細(xì)胞24h，免疫熒光結(jié)果顯示:MDA-MB-231細(xì)胞胞質(zhì)中LC3

6、蛋白表達(dá)增加。免疫印跡結(jié)果顯示:LC3基因在蛋白表達(dá)水平較空白對照組相比明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4、EPI處理MTDH基因下調(diào)后的MDA-MB-231細(xì)胞24h，免疫印跡結(jié)果顯示:EPI+MTDH-shRNA組LC3基因在蛋白水平上表達(dá)較EPI組及EPI+Control-shRNA組均減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而EPI組與EPI+Control-shRNA組無明顯差異。
　　5、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，EPI+MTDH

7、-shRNA轉(zhuǎn)染組總凋亡率及早期凋亡率均較EPI組及EPI+Contro1-shRNA轉(zhuǎn)染組明顯增高，而EPI+Control-shRNA轉(zhuǎn)染組與EPI組無明顯差異。提示下調(diào)MTDH基因可促進(jìn)EPI處理的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:EPI可以誘導(dǎo)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞自噬的表達(dá)，下調(diào)MTDH基因可以促使LC3的表達(dá)減弱，抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生自噬，下調(diào)MTDH基因可以提高M(jìn)DA-MB-2