細胞自噬在表柔比星誘導(dǎo)膀胱腫瘤T24細胞凋亡中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　 1.觀察膀胱腫瘤T24細胞在EPI作用下自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3(Ⅰ、Ⅱ)表達情況，以及自噬相關(guān)通路mTOR中pAKT、AKT、p70s6k蛋白表達，并討論EPI作用后腫瘤細胞自噬的可能機制。
　　 2.調(diào)節(jié)膀胱腫瘤T24細胞自噬表達水平，觀察緬胞對于EPI治療敏感性的變化以及自噬相關(guān)基因Beclin-1和LC3 mRNA和蛋白表達情況，并討論自噬在膀胱腫瘤化療中的作用。
　　 方法:<

2、br>　　 1.不同濃度化療藥物EPI作用于膀胱腫瘤T24細胞24h，MTT檢測藥物對膀胱腫瘤細胞增殖抑制率的影響，Western blot檢測Beclin-1、LC3(Ⅰ、Ⅱ)、pAKT、AKT、p70s6k等蛋白表達，RT-PCR檢測LC3、Beclin-1的mRNA轉(zhuǎn)錄情況水平。免疫熒光檢測LC3(Ⅰ、Ⅱ)蛋白表達。
　　 2.用MTT篩選出EPI處理濃度，EPI濃度為1mg·L-1，3-MA濃度為10mmol·L-1。

3、將實驗分為正常對照組、EPI組、EPI聯(lián)合自噬抑制劑3-MA組，及單用3-MA組，藥物處理膀胱腫瘤T24細胞24h后，MTT和流式細胞術(shù)分別檢測藥物對細胞增殖抑制率和細胞凋亡率的影響，免疫熒光檢測LC3(Ⅰ、Ⅱ)表達，RT-PCR及Western blot檢測Beclin-1和LC3 mRNA和蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度EPI作用于T24細胞24 h后，可明顯抑制細胞增殖，并呈濃度依賴性。Wester

4、n blot檢測顯示，膀胱腫瘤細胞經(jīng)EPI處理后，自噬相關(guān)基因LC3(Ⅰ、Ⅱ)、Beclin-1表達增強，隨EPI藥物濃度的增加而表達增加。免疫熒光和RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因LC3(Ⅰ、Ⅱ)、Beclin-1表達結(jié)果與Western blot檢測結(jié)果相似。而Western blot檢測顯示，自噬上游mTOR通路中pAKT、p70s6k蛋白表達均有明顯下降，且隨著EPI藥物濃度的增加而表達下降，AKT表達無明顯變化。
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5、.EPI可以促進自噬相關(guān)基因LC3(Ⅰ、Ⅱ)及Beclin-1表達;3-MA單獨使用時抑制了T24細胞自噬相關(guān)基因LC3(Ⅰ、Ⅱ)及Beclin-1的表達，對T24細胞增殖有明顯抑制，但細胞凋亡率同正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。EPI聯(lián)合自噬抑制劑3-MA作用后，自噬相關(guān)基因LC3(Ⅰ、Ⅱ)及Beclin-1表達較EPI組有明顯下降，而細胞增殖抑制率從（36.99±0.69）％增加到(57.65±2.97)％，細胞凋亡率從(22.3