靶向AR基因的RNA干擾誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 多年來關(guān)于膀胱癌的一個問題一直存在--為什么男性患者大約是女性患者的3倍之多?長期以來認(rèn)為這要?dú)w因于男性的高吸煙率和高風(fēng)險的工作,但是隨著各行各業(yè)女性工作者和女性煙民數(shù)量的大量增加,這一差距并沒有改變。
　　 性激素在致癌過程中的作用日益引起人們的關(guān)注。最初對性激素的研究均注重于性激素的靶器官,如乳腺、卵巢、前列腺等。1984年Ahmed[1]證實(shí)在腎癌組織中存在雄激素受體(Androgen Rece

2、ptor,AR)、雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)和孕激素受體(ProgesteroneReceptor,PR),泌尿系腫瘤與性激素間的關(guān)系令人矚目。膀胱癌是泌尿系最常見的腫瘤,也是性別差異較大的腫瘤之一。隨著在膀胱癌組織中相繼發(fā)現(xiàn)了AR、ER和pR,有人認(rèn)為性激素通過其受體在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中有一定作用。
　　 AR在人體組織分布很廣泛,除了在前列腺、精囊等生殖器官外,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌以及腎臟

3、、肝臟組織中都存在AR。在人類的腫瘤中,前列腺癌、肝癌、大腸癌、黑色素瘤中都有AR。在膀胱癌組織中也有AR,李世文[3]等檢測64例膀胱移行細(xì)胞癌,AR陽性率為78.13％,高于17例正常膀胱粘膜AR陽性率41.18％;在64例膀胱癌中,8例Ⅰ級膀胱癌AR陽性率100％,27例Ⅱ級癌AR陽性率81.48％,29例Ⅲ-Ⅳ級癌.AR陽性率68.97％,提示膀胱癌AR陽性率隨腫瘤分級增加而降低。同時還發(fā)現(xiàn)同一患者的癌組織AR陽性率高于癌旁組織

4、及自身膀胱粘膜,原發(fā)腫瘤的AR陽性率高于復(fù)發(fā)腫瘤,程榮璇[6]等檢測93例膀胱移行細(xì)胞癌,AR陽性率為52.68％,AR陽性患者中多發(fā)性癌較高,非浸潤性癌的AR陽性率高于浸潤性癌,分化好的AR陽性率高于分化差的,并認(rèn)為AR可能是膀胱癌新的生物學(xué)標(biāo)記,檢測AR對預(yù)測膀胱癌預(yù)后有重要意義。
　　 化療藥物灌注膀胱誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡已成為膀胱癌術(shù)后輔助治療的主要手段。然而臨床結(jié)果顯示灌注后仍有較高的復(fù)發(fā)率。其主要原因就是對化療藥物耐藥及敏

5、感性下降,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不足。有大量資料顯示,在許多腫瘤細(xì)胞的凋亡中發(fā)現(xiàn)有Caspase的活化。在此傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用的caspase-3在許多正常組織和腫瘤組織中表達(dá),而且許多腫瘤治療是通過caspase-3途徑介導(dǎo)的。Caspase-3表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞凋亡減少,可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[51-54]。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)作為一種高效的基因沉默技術(shù),有望成為基因治

6、療的有效手段。通過RNAi實(shí)現(xiàn)對AR的沉默,能夠分析其在腫瘤中的作用:雄激素是否通過AR促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的增殖能力?AR與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的關(guān)系如何?其機(jī)制可能是什么?
　　 圓滿地解決這些問題,必然將找到預(yù)防和治療膀胱癌的新途徑,延長膀胱癌患者的生命,具有潛在的經(jīng)濟(jì)與社會效益。
　　 正是在這樣的前提與背景下,本研究擬準(zhǔn)備:
　　 ①研究雄激素對膀胱癌細(xì)胞株T24的生長的影響,其與AR表達(dá)之間的關(guān)系;

7、
　　 ②構(gòu)建靶向于AR的慢病毒載體;
　　 ③探討AR在絲裂霉素C誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞系凋亡中所發(fā)揮的作用及其與凋亡信號通路的聯(lián)系,從而為抑制膀胱癌細(xì)胞增殖治療和加強(qiáng)化療藥物對膀胱癌細(xì)胞的作用效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分:不同水平DHT對膀胱癌細(xì)胞株T24生長及其AR表達(dá)的影響
　　 目的：探討DHT對膀胱癌細(xì)胞株T24及其AR表達(dá)的作用。
　　 方法：采用細(xì)胞培養(yǎng)和RT-PCR方法研究不

8、同的DHT濃度(0、10-10M、10-9M、10-8M)對膀胱癌細(xì)胞株(T24)中ARmRNA的表達(dá)MTT法測細(xì)胞生長曲線,觀察其對細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：Real-time PCR擴(kuò)增良好。溶解曲線圖中沒有出現(xiàn)雜峰,也未出現(xiàn)主峰的異常增寬,表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。分析數(shù)據(jù)提示不同DHT濃度對AR表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)。而在不同水平DHT培養(yǎng)T24細(xì)胞第4天和第5天MTT檢測結(jié)果分析顯示光

9、吸收值無顯著性差異(P＞0.1)。
　　 小結(jié)：T24細(xì)胞表達(dá)AR;DHT濃度對AR表達(dá)無明顯影響;DHT對T24細(xì)胞無直接刺激增殖作用。
　　 第二部分:AR基因RNA干擾慢病毒載體制備
　　 目的：制備靶向于AR的干擾慢病毒載體,為進(jìn)一步研究AR提供條件。
　　 方法：針對AR基因靶基因序列,利用公用網(wǎng)站按照RNA干擾序列設(shè)計原則,設(shè)計2個RNA干擾靶點(diǎn)序列,使用雙鏈DNA oligo，其兩端含酶切位

10、點(diǎn)粘端,直接連入酶切后的RNA干擾載體上。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細(xì)胞,對長出的克隆先進(jìn)行PCR鑒定,在進(jìn)行測序比對后,鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNA干擾慢病毒載體。通過RT-PCR檢測兩種慢病毒載體感染T24細(xì)胞后,AR基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：通過陽性克隆測序,證實(shí)兩條序列構(gòu)造載體分別成功。慢病毒滴度測定兩個病毒載體滴度分別為1E+9,2E+9 TU/mL。從熒光觀察結(jié)果可見:T24細(xì)胞的感染效率都達(dá)

11、到80％以上。T24細(xì)胞中,KD1,KD2組對AR基因的表達(dá)有顯著敲減效果。相對NC組,KD1,KD2組對AR基因敲減效率分別達(dá)到85％以上(P＜0.05)。
　　 小結(jié)：利用RNAi的理論和方法制備出2個靶向AR基因的慢病毒載體。
　　 第三部分:AR影響絲裂霉素誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞系凋亡及其機(jī)制研究
　　 目的：探討AR在絲裂霉素誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞系凋亡中所發(fā)揮的作用,從而為抑制膀胱癌細(xì)胞增殖治療和加強(qiáng)化療

12、藥物對膀胱癌細(xì)胞的作用效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：采用RNAi及MTT和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等方法觀察AR對絲裂霉素C誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的影響。Realtime RT-PCR技術(shù)檢測T24細(xì)胞中ARNRNA和caspase3mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：分別于轉(zhuǎn)染后RT-PCR檢測AR及caspase3的表達(dá),ARmRNA顯著降低(P＜0.05),而caspase-3顯著增高(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測空白組、陰

13、性對照組及轉(zhuǎn)染組MMC作用的凋亡率結(jié)果,在不加化療藥物的情況下,單純轉(zhuǎn)染RNA干擾載體,細(xì)胞的凋亡率與轉(zhuǎn)染前相比稍有升高,在MMC的作用下,抑制AR的表達(dá)后,細(xì)胞的凋亡率可明顯升高,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(35.38±1.54)％,明顯高于空白組(15.67±1.23)％與陰性對照組(17.43±1.45)％,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 小結(jié)：AR-siRNA介導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞系凋亡可能通過caspase途徑。AR明