Bcl-xl基因在膀胱癌中表達(dá)與RNA干擾的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Bcl-xl基因在膀胱癌中表達(dá)與RNA干擾的實(shí)驗(yàn)研究膀胱腫瘤是泌尿外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其臨床特點(diǎn)主要是高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和低度惡性。目前認(rèn)為膀胱腫瘤是一基因病，由多通路及多靶位調(diào)控，但其確切病因、發(fā)病機(jī)制及復(fù)發(fā)機(jī)制不清楚。近年來(lái)有關(guān)膀胱腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，其中包括基因突變、原癌基因激活、抑癌基因失活及凋亡失衡等多種發(fā)病機(jī)制。 凋亡即細(xì)胞的程序性死亡，其調(diào)節(jié)機(jī)制的紊亂將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究表明，腫瘤細(xì)胞凋亡的減少

2、與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的密切相關(guān)。并且使細(xì)胞耐受放療、化療的刺激。因而，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為了一種新的殺傷腫瘤細(xì)胞的治療策略。 Bcl-xl作為一種抗凋亡蛋白基因，可保護(hù)細(xì)胞免于病毒、氧化劑等刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-xl蛋白的高表達(dá)是腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一。因此，利用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)抑制Bcl-xl蛋白基因的表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的，是目前正積極探索的一條新的腫瘤治療途徑。Bcl-xl屬Bcl-2抗凋亡家

3、族成員，其在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達(dá)豐富，能抑制多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 RNA干擾(RNAi)是一種序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)并導(dǎo)致與dsRNA序列同源的mRNA降解。向哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染雙鏈siRNA可導(dǎo)致快速的和有效的靶基因mRNA降解，并避免了由長(zhǎng)的雙鏈RNA觸發(fā)的非特異效應(yīng)。目前，RNAi己廣泛應(yīng)用于基因組功能、抗病毒和抗腫瘤治療的研究。 本研究應(yīng)用免疫組化方法測(cè)定Bcl-xl

4、及其相關(guān)基因Bak在膀胱癌組織中的蛋白表達(dá)，并利用體外轉(zhuǎn)錄合成的的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)引發(fā)膀胱癌細(xì)胞株T24Bcl-xl基因沉默，借此研究對(duì)人膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為利用RNA干擾進(jìn)行膀胱癌的治療提供理論基礎(chǔ)。 目的： 1.研究凋亡抑制基因Bcl-xl及其相關(guān)基因Bak在膀胱癌組織中的表達(dá)，并探討其與膀胱癌惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系。 2.建立體外siRNA的合成

5、制備方法，為RNA干擾的進(jìn)一步研究提供技術(shù)平臺(tái)。 3.觀察膀胱癌細(xì)胞株T24中siRNA對(duì)Bcl-xl表達(dá)的抑制作用。 4.觀測(cè)siRNA體外抑制膀胱癌細(xì)胞Bcl-xl基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)及其對(duì)化療藥物順鉑(DDP)的增效作用。 方法： 1.對(duì)49例膀胱癌患者的臨床病理資料進(jìn)行回顧性分析。應(yīng)用Bcl-xl和Bak的抗體對(duì)上述患者的腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2.在ww

6、w.oligoengine.com上進(jìn)行設(shè)計(jì)，得到三條siRNA序列。利用T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄合成單鏈RNA，退火后得到dsRNA，對(duì)dsRNA進(jìn)行消化并純化，獲得高純度的Bcl-xlsiRNA。 3.利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞中，半定量RT-PCR法篩選有效的靶序列，western-blot檢測(cè)siRNAs的抑制效應(yīng)。 4.應(yīng)用丫啶橙染色觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)變化，集落細(xì)胞形成試驗(yàn)、MTT法檢測(cè)

7、siRNAs對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制的效應(yīng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNAs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。 5利用MTT檢測(cè)siRNA對(duì)化療藥物順鉑(DDP)的增效作用。 6.統(tǒng)計(jì)方法：應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和方差分析來(lái)分析比較各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 結(jié)果： 1在TCCB中Bcl-xl、Bak有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，二者差異均有顯著性，隨著TCCB臨床病理分期、分級(jí)的升高，Bcl-xl和Bak的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、；Bcl-xl、Bak表達(dá)情況與腫瘤臨床病理分期、分級(jí)有相關(guān)性。 2成功體外合成3條siRNA，長(zhǎng)度為21bp。 3與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA的T24細(xì)胞Bcl-xlmRNA表達(dá)水平明顯下降。 4western-blot表明T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染組Bcl-xl蛋白表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5MTT結(jié)果：兩處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后每天所測(cè)抑制率均顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)表明細(xì)胞經(jīng)siRNA3

9、處理后生長(zhǎng)受到明顯抑制：兩處理組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨時(shí)間而增高，表明siRNA對(duì)癌細(xì)胞的抑制可維持一定時(shí)間。 6集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果：A、B、C三組細(xì)胞在第7天集落形成數(shù)分別為237±8、202±10、87±11，處理組明顯低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明處理組細(xì)胞在Bcl-xl受抑后，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受到明顯抑制。 7.FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA3組轉(zhuǎn)染24h后即可見(jiàn)凋亡峰(Ap峰)，并隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)漸趨明顯，24h后siRNA組細(xì)胞

10、凋亡指數(shù)(AI)已明顯高于對(duì)照組；AO熒光染色顯示細(xì)胞萎縮、染色質(zhì)濃縮、胞核致密濃染等典型凋亡改變。 結(jié)論： 1.膀胱癌組織中Bcl-xl、Bak表達(dá)明顯高于正常組織，且在膀胱細(xì)胞系T24中同樣檢測(cè)到了Bcl-xl的高表達(dá)。表明Bcl-xl與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可望成為膀胱癌的病情檢測(cè)及早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志。 2.體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNAs能特異有效的下調(diào)Bcl-xl基因的表達(dá)，不同序列特異性的siRNA