XPC、XPA基因在膀胱癌中的表達.pdf

1、背景和目的： 人類細胞中基因組DNA不斷受到內(nèi)源性和環(huán)境因素的損傷。內(nèi)源性因子如細胞代謝中間產(chǎn)物及毒素、環(huán)境因素包括紫外線、化學(xué)毒物等都可導(dǎo)致DNA損傷。DNA損傷后，首先通過對損傷的感知(sensors)和識別，經(jīng)過某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生以下效應(yīng)：DNA修復(fù)；旁路復(fù)制以及凋亡(apoptosis)。DNA修復(fù)是維持細胞遺傳穩(wěn)定性和高保真性的重要機制。如果DNA修復(fù)發(fā)生改變，將導(dǎo)致?lián)p傷的DNA不能修復(fù)或不能J下確修復(fù)從而發(fā)生突變，突

2、變的的發(fā)生將最終導(dǎo)致許多遺傳性疾病的產(chǎn)生和癌癥的發(fā)生(carcinogenesis)。 根據(jù)DNA損傷的性質(zhì)，DNA修復(fù)途徑可分為：(1)堿基切除修復(fù)；(2)核苷酸切除修復(fù)(nucleotideexcisionrepair，NER)；(3)錯配修復(fù)；(4)重組修復(fù)。在眾多的DNA修復(fù)途徑和機制中，NER是主要的修復(fù)途徑，能夠修復(fù)大量的：DNA損傷，所以NER在維持基因組穩(wěn)定性和高保真性方面發(fā)揮著重要作用。 NER有兩個分

3、途徑：即基因組修復(fù)(GlobalGenomeRepairGGR)和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)(Transcription-Coupled.Repair，TCR)。GGR參與基因組任何序列損傷的修復(fù)，對于阻止癌癥的發(fā)生具有重要作用。TCR修復(fù)具有轉(zhuǎn)錄活性基因轉(zhuǎn)錄鏈上的DNA損傷，其主要作用是延緩衰老過程。這兩個NER分途徑都有四個步驟：(1)損傷識別和剪切復(fù)合體的聚集；(2)螺旋雙鏈解旋；(3)損傷切除；(4)DNA修復(fù)合成以及雙鏈連接；其中DNA損傷

4、識別最為重要，只有損傷的DNA被識別后，后續(xù)修復(fù)過程才能啟動。XPC(xerodermapigmentosumgenegroupC，XPC)蛋白與hHR23B結(jié)合，在GGR過程中發(fā)揮著識別作用；而XPA(xerodermapigmentosumgenegroupA，XPA)在GGR和TCR途徑的交叉位點發(fā)揮作用，沒有XPA的參與，GGR和TCR都不能夠發(fā)生。 XPC最初從著色性干皮病(xerodermapigmentosum，X

5、P)發(fā)現(xiàn)的，作為一種常染色體隱性遺傳病，著色性干皮病的最主要特征是患者皮膚對陽光敏感并可在幼年發(fā)展為瘍。隨后幾乎90％的病人會在十多歲發(fā)生基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤等皮膚癌。在紫外線作用下，XP患者罹患皮膚癌的機率顯著高于正常，約為正常人的2000倍。cleaver等首先發(fā)現(xiàn)該病是由于患者對紫外線照射造成的核苷酸損傷切除修復(fù)缺陷所致。隨著研究的深入，到目前已有7組互補型及一種XP變異型被發(fā)現(xiàn)，與之相對應(yīng)的基因分別被命名為XPA、X

6、PB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG和XPV。 XPC基因由15個外顯子組成，約17kb大小，定位于3p25。XPC蛋白存在于細胞核中，有證據(jù)顯示，XPC蛋白可與hHR23B基因的表達產(chǎn)物緊密結(jié)合形成一個異二聚體，在GGR途徑中起著DNA識別的作用。有研究表明，XPC在肺癌中低表達，并且低表達的XPC與肺癌的發(fā)生具有一定的聯(lián)系。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，XPC在膀胱癌細胞株HT1197中低表達。同時有研究發(fā)現(xiàn)，xpc-/-小鼠

7、中，膀胱癌的發(fā)生率升高。然而，對于XPC在膀胱癌組織中的表達，目前尚不明確。 XPA在NER過程中發(fā)揮著不可替代的作用，xpa-/-小鼠體內(nèi)沒有NER機制。XPA基因含六個外顯子，不同的外顯子編碼不同的氨基酸結(jié)構(gòu)。其中E1編碼與RPA34結(jié)合結(jié)構(gòu)，E2編碼與ERCCl結(jié)合結(jié)構(gòu)，E3編碼鋅指結(jié)構(gòu)，E4和E5編碼loop-richsubdomain，與DNA結(jié)合，E6編碼TEIIH結(jié)構(gòu)。其中任何一個結(jié)構(gòu)變異，都將導(dǎo)致NER機制效率降

8、低甚至不能發(fā)生。UV照射xpa-/-小鼠后發(fā)現(xiàn)，其各種癌癥(包括膀胱癌)發(fā)生率比正常小鼠明顯升高。由此可以推測，XPA基因的表達狀況，在膀胱癌發(fā)生方面，具有一定的影響。 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)高發(fā)性腫瘤，其中膀胱移行細胞癌占90％。膀胱癌的致病因素主要有：吸煙，工業(yè)相關(guān)的胺類以及人體攝入的某些藥物。由于膀胱為空去腔型器官，膀胱粘膜長期暴露于尿液當中，尿液中的各種物質(zhì)不斷的造成DNA損傷，因此DNA修復(fù)對于膀胱癌來說至關(guān)重要。由于NER

9、機制能夠修復(fù)大量的DNA損傷，對于保持細胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要作用因此，研究NER.機制在膀胱癌中作用，可能為膀胱癌的防治提供新的線索。 鑒于XPC、XPA在NER機制中的重要作用，本課題采用了Real-timePCR法比較膀胱癌組織與正常膀胱組織中XPC，XPA基因在RNA水平表達的差異性。Real-timePCR是一種高效敏感的mRNA檢測方法，其準確性和特異性比以往的Northern等檢測mRNA的方法有很大的提高。為

10、檢測XPC、XPA蛋白在膀胱癌組織中的表達，本課題還采用WesternBlot比較膀胱癌組織與正常膀胱組織中XPC、XPA在蛋白水平的差異。此外，本課題中還用順鉑誘導(dǎo)膀胱癌細胞株BIU-87，5637,Real-timePCR檢測分析順鉑處理前后膀胱癌細胞株中XPC、XPA的表達，對XPC、XPA與膀胱癌耐藥性之間的關(guān)系，做了初步研究。 方法： XPC、XPA在膀胱癌組織中的表達。取西南醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除標本(27例膀

11、胱癌)，液氮冰凍保存。提取膀胱癌組織和正常組織中RNA，Real-timePCR法比較XPC、XPA的表達；提取組織中總蛋白，Western:Blot檢測XPC、XPA蛋白表達。 膀胱癌耐藥性與NER基因XPC、XPA的關(guān)系。培養(yǎng)膀胱癌細胞株BIU-87，5367，用化療藥物順鉑刺激細胞株之后，提取細胞中RNA，檢測XPC、XPA的表達，與未用順鉑處理的BIU87，5367細胞株中XPC、XPA表達作比較。 結(jié)果：

12、 成功提取膀胱癌組織中RNA，并建立Real-time定量PCR反應(yīng)條件體系：在采用real-time定量PCR法檢測基因表達之前，首先要建立定量PCR的反應(yīng)條件，使反應(yīng)的擴增效率在90～110％之間，同時所設(shè)計的real-timePCR引物必需具有擴增特異性。 采用Real-timePCR檢測了膀胱癌與膀胱組織中XPC、XPA的表達差異，膀胱癌中XPC、XPA表達明顯低于正常膀胱組織(P＜0.01)。此外，結(jié)合臨床資料，我們

13、發(fā)現(xiàn)化療病人的膀胱癌組織中XPC、XPA的表達比沒有經(jīng)過化療的膀胱癌組織中XPC、XPA的表達高(P＜0.05)。 成功提取了組織中的總蛋白，并采用western檢測了膀胱癌組織以及膀胱組織中XPC、XPA蛋白表達，最終發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中XPC、XPA蛋白的表達比正常膀胱組織中低(P＜0.01)。 成功培養(yǎng)BIU87、5637膀胱癌細胞株，并用化療藥物順鉑處理了其中一批細胞，之后，提取細胞中的RNA，比較藥物處理前后XPC、

14、XPA的表達差異性，最終發(fā)現(xiàn)，順鉑誘導(dǎo)后，膀胱癌細胞株BIU-87，5637的表達明顯升高(P＜0.01)。 結(jié)論： 膀胱癌組織中XPC、XPA的在RNA水平的表達比正常膀胱組織中低，并且低表達的XPC、XPA基因與膀胱癌的發(fā)生具有一定的關(guān)系。 化療病人的膀胱癌組織中，XPC、XPA在RNA水平的表達升高，以及膀胱癌細胞株BIu-87和5637在經(jīng)過順鉑誘導(dǎo)后，XPC、XPA的表達升高，這一結(jié)果初步說明了XPC、