HMGB1基因沉默對(duì)化療藥物誘導(dǎo)小鼠前胃癌細(xì)胞自噬的影響.pdf

1、胃癌是目前最常見(jiàn)消化道腫瘤之一，化療是治療胃癌的三大主要手段之一，臨床應(yīng)用中往往出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象（MDR），其詳細(xì)分子機(jī)制仍然值得探索。近年研究表明HMGB1誘導(dǎo)自噬并參與了結(jié)直腸癌、骨髓瘤、白血病等的耐藥。但HMGB1在胃癌細(xì)胞耐藥的作用機(jī)制仍不清楚。本研究試圖沉默HMGB1基因，探討自噬的改變對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥的影響。
　　第一部分構(gòu)建pNL-ShHMGB1慢病毒載體：首先設(shè)計(jì)并合成針對(duì)HMGB1 mRNA四個(gè)靶位點(diǎn)下調(diào)的ssRN

2、A，退火生成dsRNA連接在pSilencer1.0載體上。酶切ShRNA表達(dá)框并將目的片段克隆到pNL慢病毒載體上并經(jīng)過(guò)PCR篩選，酶切和測(cè)序鑒定，確保該片段正確克隆到慢病毒載體pNL上。
　　第二部分篩選能夠誘導(dǎo)小鼠前胃癌細(xì)胞（mouse forestomach carcinoma cells, MFC）發(fā)生自噬的化療藥物：采用MTT方法檢測(cè)吉非替尼(gefitinib Gef)、阿霉素（doxorubicin DOX)、格爾

3、德霉素(geldanamycin GA)、絲裂霉素（mitomycin MMC）對(duì)MFC細(xì)胞增殖抑制影響并計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）；其半數(shù)抑制濃度作用于MFC細(xì)胞檢測(cè)其LC3-Ⅱ表達(dá)量，篩選出誘導(dǎo)MFC細(xì)胞發(fā)生自噬的藥物。結(jié)果提示，DOX、Gef、GA可誘導(dǎo)MFC細(xì)胞發(fā)生自噬且具有時(shí)間和劑量的依賴(lài)性。
　　第三部分沉默 HMGB1蛋白對(duì)化療藥物誘導(dǎo) MFC細(xì)胞自噬的影響：pNL-ShHMGB1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至MFC細(xì)胞，檢

4、測(cè)HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)量，Q-PCR結(jié)果提示四個(gè)靶位點(diǎn)均能夠下調(diào)HMGB1 mRNA的表達(dá)，尤其是針對(duì)HMGB1 BOX的第三個(gè)靶位點(diǎn)下調(diào)效果最為明顯（P＜0.01）；Western Blot結(jié)果提示pNL-ShHMGB1-3/4可成功下調(diào) HMGB1蛋白。將篩選出的pNL-ShHMGB1-3/4質(zhì)粒和pHelper及pVSVG共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝慢病毒，慢病毒滴度為2×107 TU/ml。由于本實(shí)驗(yàn)慢病毒感染 MFC效