FIP200在ATRA誘導(dǎo)NSCs自噬、分化和凋亡過(guò)程中表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　本課題通過(guò)采用從小到大不同濃度ATRA誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠NCSs，研究在此條件下細(xì)胞發(fā)生自噬、分化和凋亡過(guò)程當(dāng)中FIP200蛋白和它的相互作用蛋白的表達(dá)水平改變，來(lái)初步證實(shí)維甲酸是通過(guò)影響FIP200的蛋白表達(dá)水平來(lái)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞不同生物過(guò)程進(jìn)行調(diào)控的，同時(shí)研究自噬分別與分化和凋亡的關(guān)系，從而為進(jìn)一步揭示維甲酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的影響提供依據(jù)。
　　方法：
　　從孕14.5天C57BL/6J小鼠胎鼠中分離得到大腦組織進(jìn)

2、行提取細(xì)胞為NSCs，通過(guò)光學(xué)顯微鏡下觀察及分化后的免疫熒光染色鑒定。第三代神經(jīng)干細(xì)胞分別加入不同濃度大小的ATRA（0、0.1、0.5、1、5、10、15、20μM）誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，吖啶橙（AO染色）計(jì)數(shù)自噬發(fā)生率，為檢測(cè)LC3-Ⅱ，用RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FIP200和p53基因蛋白的表達(dá)水平，研究維甲酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞FIP200和自噬水平變化的作用。加入較低濃度的ATRA（0、0.1、0.5、1、5μM）誘導(dǎo)7天，運(yùn)用細(xì)胞

3、免疫熒光法及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組分化率，加入自噬抑制劑LY294002后，檢測(cè)1μM ATRA誘導(dǎo)NSCs的分化率變化，研究ATRA誘導(dǎo)NSCs分化與自噬的關(guān)系；以及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RB1表達(dá)水平。加入較高濃度的ATRA（5、10、15、20、40μM）誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡率，再次運(yùn)用RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法技術(shù)檢測(cè)此5組FIP200蛋白的表達(dá)水平，加入自噬抑制劑后比較凋亡率的變化，研究ATRA誘導(dǎo)NS

4、Cs凋亡與自噬的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　(1)胎鼠大腦組織中可以提取出NSCs，鏡下觀察呈圓球狀生長(zhǎng)，細(xì)胞分化熒光鑒定結(jié)果得以再次證實(shí)。
　　(2)不同濃度維甲酸誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞，F(xiàn)IP200蛋白和自噬水平是先增高后下降的趨勢(shì)，P53則相反。
　　(3)低濃度的維甲酸誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化與FIP200表達(dá)成正相關(guān)，抑制自噬不能抑制分化，分化與RB1有關(guān)。
　　(4)高濃度的維甲酸誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡與FIP200