骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元電生理特性和神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體差異表達(dá)研究.pdf

1、骨髓中除含造血干細(xì)胞外，還存在一種多向分化的干細(xì)胞，被稱之為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs具有高度可塑性，在一定誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化的能力；同時，MSCs還可以向外胚層的神經(jīng)細(xì)胞分化。近年來，MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化的研究受到了極大的關(guān)注。國內(nèi)外許多學(xué)者利用不同的誘導(dǎo)劑，在體外將MSCs誘導(dǎo)為能表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元及星

2、形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的細(xì)胞。目前，由MSCs向神經(jīng)元分化的研究主要集中在體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植兩方面內(nèi)容。雖然研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但存在的共同問題是各家在研究方向及方法上存在著相當(dāng)大的差異，研究系統(tǒng)不夠完善，缺乏理想的標(biāo)記物來認(rèn)證MSCs本身。此外，更重要的是，雖然MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物，如NF、NSE、GFAP等，并在形態(tài)上與神經(jīng)細(xì)胞相似，但憑其就認(rèn)為MSCs已轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞，證據(jù)尚不充分，需進(jìn)一步測試其是否具有神

3、經(jīng)細(xì)胞的一系列功能。細(xì)胞膜離子通道充分代表了某種細(xì)胞的生物學(xué)性狀、本質(zhì)及功能，因此了解MSCs在生長、分化過程中電生理特性情況，無疑對MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的認(rèn)證，以及對其最終分化成為功能性神經(jīng)元細(xì)胞的確認(rèn)有著重大意義。 本研究利用膜片鉗技術(shù)，比較MSCs及誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞之間通道電流的情況，進(jìn)一步確認(rèn)誘導(dǎo)后細(xì)胞的電生理功能，將為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供前期工作基礎(chǔ)。 目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植治療存在一個問題就

4、是MSCs移植治療時細(xì)胞死亡，存活少。所以阻止這個過程對于神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行疾病治療是非常重要的。 MSCs是來源于成體干細(xì)胞具有分化成為各種細(xì)胞包括神經(jīng)細(xì)胞的潛能，已成為細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病移植細(xì)胞的來源。但這種治療潛能依靠移植細(xì)胞的存活和功能。MSCs源性神經(jīng)元細(xì)胞移植治療可以促進(jìn)神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行疾病的功能恢復(fù)，這些細(xì)胞移植后依靠存活進(jìn)入到損傷部位，分泌必需的生長因子而促進(jìn)了損傷部位的恢復(fù)。神經(jīng)營養(yǎng)因子(nerve

5、 nutrition factors，NTFs)及其受體是蛋白質(zhì)家族，這個蛋白質(zhì)家族三個重要的成員是神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)，是神經(jīng)元在胚胎期及發(fā)育期成活和發(fā)育所必需的一些蛋白質(zhì)，是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、軸突生長、突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生。TrkA、TrkB和TrkC分別是NGF、BDNF和NT.3的高親和力受體，P75是共同的低親和力受體。當(dāng)TrkA、

6、TrkB、TrkC和P75在神經(jīng)細(xì)胞膜表達(dá)時，這些生長因子通過神經(jīng)靶細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。 研究NTFs及其受體在MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞前后的表達(dá)結(jié)果，對探索體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞移植中促進(jìn)細(xì)胞存活阻止凋亡具有的理論指導(dǎo)意義。 本研究主要內(nèi)容如下： 第一部分骨髓MSCs定向誘導(dǎo)分化神經(jīng)元的研究 1.研究方法:采用全骨髓法分離培養(yǎng)成年SD大鼠MSCs，傳至第5代的MSCs用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞

7、表面抗原CD29、CD44、CD34和CD45。以DMS0、BHA與Forskolin等誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元。免疫熒光檢測MSCs及誘導(dǎo)后不同時間神經(jīng)元特異性抗原nestin、NF-200和GFAP表達(dá)情況。 2.研究結(jié)果: 傳至第5代MSCs的表面抗原CD29和CD44陽性率分別為98.80％和96.61％，CD34.和CD45陰性。MSCs誘導(dǎo)后30min可見神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn)。免疫熒光分別檢測了MSCs

8、及誘導(dǎo)后6h、12h、24h的nestin、NF-200和GFAP表達(dá)。MSCs誘導(dǎo)后6h、12h和24h nestin陽性率分別為90.5±1.9％，83.1±5.4％和33.5±5.4％；NF-200陽性率分別為90.1±2.9％，97.5±1.3％和98.1±1.6％。結(jié)果顯示MSCs分化過程中一過性表達(dá)nestin，以后隨時間延長逐漸減低。NF-200在6h陽性率隨誘導(dǎo)時間延長而增加，陽性率達(dá)90％。GFAP在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后均未

9、表達(dá)。研究結(jié)果提示大鼠骨髓來源的MSCs可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，分化率高。經(jīng)定向誘導(dǎo)發(fā)育的MSCs源性神經(jīng)元有望成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞移植治療的理想細(xì)胞來源。 第二部分骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的電生理功能研究 1.研究方法:應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，采用全細(xì)胞記錄方式，對由DMSO、BHA與Forskolin等誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)的分化前和分24h的成年大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行電生理功能檢測。 2.研究結(jié)果: 分化前

10、后的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成功記錄到了刺激脈沖為-40mV時瞬間外向鉀電流分別為：(9.95±4.85)pA/pF(n=9)和(328.50±30.62)pA/pF(n=9)；刺激脈沖為-40mV時L型鈣通道電流分別為：(-0.059±0.027)pA/pF(n=7)和(-6.66±0.50)pA/pF(n=7).伴隨著分化時間的逐漸延長，瞬間外向鉀電流和L型鈣通道電流逐漸增高。 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過DMSO、BHA與Forskolin等

11、誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)能夠向功能神經(jīng)元分化。 第三部分MSCs源性神經(jīng)元移植在損傷脊髓中的存活與分化 1.研究方法:為了研究MSCs存活、分化和遷移，將誘導(dǎo)的神經(jīng)元注射到成年大鼠脊髓損傷部位.在移植后24h，1周和2周通過雙標(biāo)免疫熒光檢測脊髓組織。 2.研究結(jié)果: 結(jié)果顯示MSCs具有存活和遷移的能力，并且移植細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物NF200也表達(dá)GFAP。 MSCs在體外具有分化神經(jīng)元的潛能而且MSCs源

12、性神經(jīng)元也是很好的脊髓損傷細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來源。 第四部分骨髓MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體差異表達(dá) 1．研究方法:RT-PCR．方法檢測成年大鼠骨髓MSCs誘導(dǎo)分化前后神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF，BDNF和NT-3及其高親和力受體TrkA、TrkB、TrkC和共同的低親和力P75受體表達(dá)。 2．研究結(jié)果: 在MSCs誘導(dǎo)分化前后都表達(dá)NGF和BDNF而不表達(dá)NT-3。在誘導(dǎo)分化后12h、24

13、h和48h表達(dá)TrkA和TrkB而誘導(dǎo)分化前后TrkC均不表達(dá)。有趣的是P75在誘導(dǎo)分化后6h開始表達(dá)，48h又關(guān)閉。 神經(jīng)營養(yǎng)因子及其特定的受體在MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的研究提示神經(jīng)營養(yǎng)因子及其特定的受體差異表達(dá)對探討移植細(xì)胞的存活，成熟及改善宿主神經(jīng)元具有一定的指導(dǎo)意義。 全文總結(jié): 大鼠骨髓來源的MSCs經(jīng)DMSO、BHA與Forskolin等誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，分化率高并且具有電生理功能特