NSCs在OECs誘導(dǎo)下定向分化及分化后神經(jīng)元電生理特性的研究.pdf

1、目的：探索大鼠嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells，OECs)對神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)分化的影響，并記錄分化后神經(jīng)元電生理特性。
　　 方法：①健康新生SD大鼠10只，取大腦皮層組織，用含2％B27、1％N2、20ng/ml堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和20ng/ml表皮生長因子(epidermal g

2、rowth factor，EGF)的培養(yǎng)液對NSCs進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每5-7天傳代一次，純化培養(yǎng)2-3代備用，免疫細(xì)胞化學(xué)法對NSCs進(jìn)行巢蛋白(Nestin)鑒定；②取新生SD大鼠嗅球，0.25％的胰蛋白酶和0.03％膠原酶37℃消化，改良Nash差速貼壁培養(yǎng)，加阿糖胞苷抑制雜細(xì)胞生長，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到大約80％時(shí)吸出上清，加入新鮮培養(yǎng)基(無血清DMEM)，反復(fù)沖洗3遍，收集條件培養(yǎng)液，每隔3天半量換液。-20℃保存條件培養(yǎng)液，免疫細(xì)胞化

3、學(xué)法對OECs進(jìn)行神經(jīng)生長因子受體p75(nerve growth factor receptor p75，NGFRp75)鑒定，直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測嗅鞘細(xì)胞純度；③實(shí)驗(yàn)組NSCs加OECs條件培養(yǎng)液及無血清DMEM/F12液培養(yǎng)，對照組NSCs只加無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3天換液。觀察細(xì)胞生長及分化情況，神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament200，NF200)鑒定神經(jīng)元，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fib

4、rillary acidic protein，GFAP)鑒定膠質(zhì)細(xì)胞，膜片鉗檢測神經(jīng)元電生理特性。
　　 結(jié)果：新生SD大鼠大腦皮層中分離培養(yǎng)出NSCs，這些細(xì)胞具有長期增殖能力，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示Nestin染色陽性；新生SD大鼠嗅球培養(yǎng)出OECs，7天NGFRp75染色見大量陽性細(xì)胞，直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測NGFRp75陽性細(xì)胞數(shù)目分別為94％、89％、97％(同一條件下檢測)；對照組NSCs克隆球少部分貼壁，未見增殖

5、分化，細(xì)胞逐漸萎縮，12天時(shí)細(xì)胞死亡，實(shí)驗(yàn)組2天后NSCs克隆球開始貼壁分化，7天時(shí)分化較明顯，10天時(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，NF200染色顯示NSCs克隆球大部分分化為神經(jīng)元，GFAP染色顯示NSCs克隆球少部分分化為膠質(zhì)細(xì)胞；全細(xì)胞膜片鉗檢測顯示分化后的神經(jīng)元記錄到快速激活快速失活、能被河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)特異阻斷的鈉電流及慢激活慢失活、能被四乙基氯化銨(tetraethylammoniumchloride，TE