aFGF誘導大鼠BMSCs分化為NSCs的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠BMSCs的體外培養(yǎng)、純化和鑒定
　　 目的:體外培養(yǎng)并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs);研究其生物學特性;檢測細胞表面標志物以鑒定細胞。
　　 方法:采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法對大鼠BMSCs進行培養(yǎng)，并通過傳代培養(yǎng)進行純化細胞。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)特征;通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法以繪制細胞的生長曲線;用流式細胞儀(FCM)測定第3代BMSCs的細胞周期，并鑒定細胞表面標志物。
　　

2、 結(jié)果:培養(yǎng)的細胞呈貼壁生長，表現(xiàn)為長梭形、多角形。第1、3、5代細胞的生長曲線均呈S形，活性無明顯差異。細胞周期顯示94.34％細胞處于G0/G1期，有較強的分裂增殖能力。FCM檢測CD29、CD54、CD90表達陽性，CD45表達陰性。
　　 結(jié)論:全骨髓貼壁培養(yǎng)法能培養(yǎng)出高純度的大鼠BMSCs。細胞生長穩(wěn)定、增殖快、可多次傳代，具有干細胞特性。
　　 第二部分 aFGF誘導大鼠BMSCs分化為NSCs并鑒定NSCs

3、
　　 目的:研究酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化為神經(jīng)干細胞(NSCs)的可行性，最佳作用劑量和最佳誘導時間，并鑒定分化前后的細胞。
　　 方法:全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠BMSCs。實驗組（aFGF誘導組-A組）分別用10、20、40、60、80、100、120ng/ml aFGF進行誘導分化，陽性對照組（bFGF誘導組-B組）用20ng/ml bFGF誘導分化，陰性對照組（

4、N組）不加任何誘導劑。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞誘導前后的形態(tài)特征變化。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測各組細胞神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的基因表達。免疫熒光染色法檢測Nestin、NSE的蛋白表達。
　　 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示Nestin、NSE mRNA在不同組均有表達，aFGF的最佳作用劑量為80ng/ml。以80ng/ml的aFGF進行后續(xù)誘導分化實驗，RT-PCR結(jié)果顯示以誘

5、導6h后A組中Nestin mRNA表達最強，與其余各組比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義;隨著誘導時間的延長，Nestin mRNA表達呈逐漸減弱趨勢。在誘導6d后各組比較，A組中NSE mRNA表達最強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。誘導6h后可見少數(shù)細胞的胞體收縮成橢圓形并伸出細長突起，免疫熒光染色顯示Nestin蛋白表達陽性;誘導6d后絕大部分細胞突起呈兩極或多極形狀，并交織成網(wǎng)狀，免疫熒光染色顯示NSE蛋白表達陽性。<